Engineering a carotenoid-binding site in Dokdonia sp. PRO95 Na+-translocating rhodopsin by a single amino acid substitution
- 作者
- Viktor A. Anashkin, Yulia V. Bertsova, Adalya M. Mamedov, Mahir D. Mamedov, Alexander M. Arutyunyan, Alexander A. Baykov, Alexander V. Bogachev
- DOI
- 10.1007/s11120-017-0453-0
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
探究钠离子转运视紫红质（NaR）缺乏类胡萝卜素光捕获天线的结构基础，并通过单氨基酸替换重建其天线功能。
研究策略
结合序列与三维结构比对、分子动力学模拟，确定关键位点Thr216；通过定点突变构建Thr216Gly变体，并在能合成类胡萝卜素的大肠杆菌菌株中异源表达；利用吸收光谱、圆二色谱、荧光激发光谱和闪光光解等手段表征类胡萝卜素结合、能量传递及光循环动力学。
核心内容
本研究以Dokdonia sp. PRO95钠转运视紫红质（NaR）为对象，探究其缺乏类胡萝卜素光捕获天线的结构原因，并尝试通过工程改造恢复该功能。作者结合序列与三维结构比对及分子动力学模拟，锁定关键残基Thr216，进而构建Thr216Gly单点突变体，并在能合成类胡萝卜素的大肠杆菌菌株中异源表达。光谱表征显示，突变体可紧密结合canthaxanthin和echinone，吸收光谱出现430、458和485 nm特征峰，类胡萝卜素与视黄醛比例约0.5:1，且类胡萝卜素向视黄醛的能量转移效率约30%。闪光光解实验表明，突变及类胡萝卜素结合未扰乱NaR的光循环动力学，K、O中间态形成与衰减时间与野生型基本一致。该结果证明仅一个氨基酸替换即可使NaR获得光捕获天线功能，且不影响离子转运活性，提示该天线在NaR进化中易于丢失亦可恢复，为视紫红质光捕获工程提供了简约有效的设计策略。
创新点
1. 鉴定出Thr216是阻碍类胡萝卜素与NaR结合的关键残基；2. 仅通过一个氨基酸替换（Thr216Gly）即赋予NaR结合类胡萝卜素并发挥光捕获天线功能的能力；3. 证明类胡萝卜素向视黄醛的能量转移效率约为30%，为视紫红质光捕获工程提供了新策略。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli / E. coli pACCAR25ΔcrtXZcrTO | 类胡萝卜素异源合成 | pACCAR25ΔcrtXZcrTO（含crtO等基因） | — | 催化 | 工程化菌株，用于合成echinone和canthaxanthin |
| Dokdonia sp. PRO95 | 光驱动Na+转运 | naR (GenBank: AEX55013) | NaR (钠转运视紫红质) | 转运 | 野生型Na+泵，本身不能结合类胡萝卜素 |
| Escherichia coli (pACCAR25ΔcrtXZcrTO) | 光驱动Na+转运 | naR (Thr216Gly突变) | T216G-NaR | 转运 | 突变体，能结合canthaxanthin和echinone并作为光捕获天线 |
| Salinibacter ruber | 光驱动H+转运 | xanthorhodopsin | Xanthorhodopsin (XR) | 转运 | 天然含类胡萝卜素天线的H+泵视紫红质，作为对照 |
| Krokinobacter eikastus | 光驱动Na+转运 | kr2 | Kr2 | 转运 | 与NaR高度同源（98%一致性），用于结构比较 |
关键发现
- Thr216Gly突变使NaR在类胡萝卜素合成的大肠杆菌中表达时，紧密结合canthaxanthin和echinone，吸收光谱出现430、458和485 nm特征峰
- 类胡萝卜素与视黄醛比例约0.5:1
- 类胡萝卜素向视黄醛的能量转移效率约30%（野生型XR约45%）
- MD模拟显示野生型XR中视黄醛C3与salinixanthin O21距离为5.3 Å，而Gly201Thr突变后该距离增大至约10 Å
- 光循环动力学在野生型NaR和T216G-NaR（含类胡萝卜素）中基本一致，K、O形成和O衰减时间分别为0.025、1.3和10 ms（野生型）与0.025、1.4和11 ms（突变体），表明突变和类胡萝卜素结合不影响NaR功能。
研究结论
单氨基酸替换Thr216Gly即可使Na+泵视紫红质获得类胡萝卜素光捕获天线功能，且不影响其离子转运光循环，提示该天线功能在NaR进化中可轻易丢失也能被恢复。