Sustainable heterologous production of terpene hydrocarbons in cyanobacteria
- 作者
- Cinzia Formighieri, Anastasios Melis
- 杂志
- Photosynthesis Research（2016）
- DOI
- 10.1007/s11120-016-0233-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
蓝藻异源生产萜烯烃（β-水芹烯）产率低，主要受限于萜烯合酶催化速率慢（kcat约4 s^-1或更慢）以及内源IPP/DMAPP前体供应不足（萜类途径仅占固定碳的4-5%）。
研究策略
将β-水芹烯合酶（PHLS）与藻蓝蛋白β亚基（CpcB）融合表达以提高酶蛋白积累量至总蛋白的20%；同时异源共表达完整的甲羟戊酸（MVA）途径和牻牛儿基焦磷酸合酶（GPPS），增强碳流向前体IPP/DMAPP和GPP的供应。
研究路线图
核心内容
该研究在蓝藻集胞藻PCC 6803中构建了异源萜烯烃生产体系，以β-水芹烯为目标产物。针对萜烯合酶催化速率慢（kcat约4 s^-1）及内源前体供应不足的双重限制，研究者将薰衣草来源的β-水芹烯合酶与藻蓝蛋白β亚基CpcB融合表达，使酶蛋白积累量从单独表达时的不足1%提升至总细胞蛋白的20%，并进一步共表达完整的甲羟戊酸（MVA）途径和牻牛儿基焦磷酸合酶（GPPS）。结果表明，单独表达PHLS时产量仅为0.33–0.50 mg/g dcw，CpcB-PHLS融合表达将产量提高至4.47–5.96 mg/g dcw，引入GPPS后达到4.90–6.68 mg/g dcw，而组合MVA途径后产量进一步攀升至9.22–12.44 mg/g dcw，较仅融合表达提高至少2倍，最佳组合平均产量约10 mg/g dcw，碳分配比约1%。该工作证明，同时满足酶浓度和前体供给两个条件，即通过融合蛋白策略补偿慢催化速率并通过MVA途径增强碳流向IPP/DMAPP的分配，是实现蓝藻高效光驱异源萜烯烃生产的关键，为蓝藻作为萜烯类工业产品的绿色合成平台奠定了基础。
创新点
1. 利用CpcB融合策略实现异源萜烯合酶在蓝藻中的超高表达（占总细胞蛋白20%）；2. 首次在蓝藻中组合CpcB-PHLS融合蛋白、MVA途径和GPPS，显著提高β-水芹烯产量；3. 明确了高效异源萜烯烃生产需同时满足酶浓度和底物供应两个先决条件。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 萜烯生物合成 | PHLS (codon-optimized, from Lavandula angustifolia) | β-phellandrene synthase (PHLS) | 催化 | 催化GPP生成β-水芹烯，kcat约4 s^-1或更慢 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 萜烯生物合成 | cpcB-PHLS (fusion) | CpcB-PHLS fusion protein | 催化 | 融合蛋白表达量可达总细胞蛋白的20%；PHLS部分催化β-水芹烯合成 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MVA途径（上游） | ATOB | 乙酰CoA乙酰转移酶 (acetyl-CoA acetyltransferase) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化乙酰CoA→乙酰乙酰CoA |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MVA途径（上游） | HMGS | 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合酶 (HMG-CoA synthase) | 催化 | 来自粪肠球菌（Enterococcus faecalis） |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MVA途径（上游） | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶 (HMG-CoA reductase) | 催化 | 来自粪肠球菌 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MVA途径（下游） | MK | 甲羟戊酸激酶 (mevalonate kinase) | 催化 | 来自肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae R6） |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MVA途径（下游） | PMK | 磷酸甲羟戊酸激酶 (phosphomevalonate kinase) | 催化 | 来自肺炎链球菌 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MVA途径（下游） | PMD | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 (diphosphomevalonate decarboxylase) | 催化 | 来自肺炎链球菌 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MVA途径（下游）/IPP异构 | FNI | 异戊烯基焦磷酸异构酶 (isopentenyl-diphosphate isomerase) | 催化 | 来自肺炎链球菌 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 萜烯生物合成 | GPPS (GPPS2 from Picea abies) | 牻牛儿基焦磷酸合酶 (geranyl diphosphate synthase) | 催化 | 催化IPP与DMAPP缩合生成GPP |
关键发现
- PHLS的kcat为4 s^-1或更慢，需高浓度酶补偿
- CpcB-PHLS融合蛋白占细胞总蛋白的20%，而PHLS单独表达时<1%
- 单独PHLS表达产量仅0.33-0.50 mg/g dcw
- CpcB-PHLS融合提高到4.47-5.96 mg/g dcw
- 再加GPPS为4.90-6.68 mg/g dcw
- 再加MVA途径达到9.22-12.44 mg/g dcw（48 h）
- 最佳组合平均产量约10 mg/g dcw，碳分配比约1%（w/w）
- 共表达MVA途径使产量较CpcB-PHLS提高至少2倍
- 内源萜类途径只占固定碳的4-5%，约85%碳流向碳水化合物。
研究结论
研究表明，通过融合蛋白策略过表达异源萜烯合酶以补偿其慢催化速率，并通过异源表达MVA途径增强内源碳流向前体IPP/DMAPP，是提高蓝藻光合固碳转化为萜烯烃产量的两个关键决定因素。该组合策略使β-水芹烯产量达到约10 mg/g dcw（碳分配比约1%），为蓝藻作为萜烯烃工业生产的绿色平台提供了可行方案。