Biosynthesis of Sesquiterpene Lactones in Pyrethrum (Tanacetum cinerariifolium)
- 作者
- Aldana M. Ramirez, Nils Saillard, Ting Yang, Maurice C. R. Franssen, Harro J. Bouwmeester, Maarten A. Jongsma
- 单位
- Plant Research International, Wageningen University and Research Centre; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University and Research Centre; Laboratory of Entomology, Wageningen University and Research Centre; Laboratory for Organic Chemistry, Wageningen University and Research Centre
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0065030
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）中倍半萜内酯（STLs）的生物合成途径，尤其是从法尼基二磷酸（FDP）经germacrene A、germacratrien-12-oic acid（GAA）到costunolide及C7-C8型STLs的关键酶促步骤。
研究策略
通过分离除虫菊腺毛构建EST文库，同源克隆候选基因，在酵母（WAT11）和本氏烟草中进行异源表达和功能验证，并通过RT-qPCR和GC-MS/LC-QTOF-MS分析基因表达与代谢物积累的相关性。
核心内容
该研究通过构建除虫菊腺毛EST文库并进行454测序，获得484,392条reads，装配成27,317个contigs和144,825条singletons，据此同源克隆了三个参与倍半萜内酯生物合成的候选基因。在酵母WAT11和本氏烟草中异源表达验证了其功能：TcGAS编码germacrene A合酶，在烟草中瞬时表达产生β-elemene；TcGAO编码germacrene A氧化酶，与TcGAS共表达于酵母可产生γ-costic acid和β-costic acid；TcCOS编码costunolide合酶，三者共表达于烟草可产生costunolide-半胱氨酸共轭物和costunolide-谷胱甘肽共轭物，质量误差分别在6 ppm和22 ppm以内。RT-qPCR显示三个基因均在腺毛中高表达且在花发育早期持续表达。该研究首次从除虫菊中克隆并功能表征了TcGAS、TcGAO和TcCOS，证明GAA是除虫菊所有倍半萜内酯的中心前体，并提示TcCOS更倾向于催化已形成C7-C8内酯环的底物发生C6-α羟基化，而催化C8-α羟基化的P450酶仍有待鉴定。
创新点
首次从除虫菊中克隆并功能表征了germacrene A合酶（TcGAS）、germacrene A氧化酶（TcGAO/CYP71AV2）和costunolide合酶（TcCOS/CYP71BL4）；提出GAA是除虫菊中所有倍半萜内酯的中心前体；发现TcCOS可能更倾向于催化已形成C7-C8内酯环的底物发生C6-α羟基化，而非游离GAA。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Tanacetum cinerariifolium | 倍半萜内酯生物合成 | TcGAS | germacrene A synthase | 催化 | 催化FDP环化生成(+)-germacrene A；GenBank登录号KC441526 |
| Tanacetum cinerariifolium | 倍半萜内酯生物合成 | TcGAO | germacrene A oxidase (CYP71AV2) | 催化 | 催化germacrene A连续氧化为germacratrien-12-醇、醛和酸（GAA）；GenBank登录号KC441527 |
| Tanacetum cinerariifolium | 倍半萜内酯生物合成 | TcCOS | costunolide synthase (CYP71BL4) | 催化 | 催化GAA或C7-C8内酯底物的C6-α羟基化，导致自发内酯化形成costunolide；GenBank登录号KC441528 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 异源表达验证 | TcGAS, TcGAO, TcCOS | germacrene A synthase, germacrene A oxidase, costunolide synthase | 催化 | WAT11酵母共表达TcGAS+TcGAO产生GAA（检测为α/γ-costic acid），共表达TcGAS+TcGAO+TcCOS产生costunolide |
| Nicotiana benthamiana | 瞬时表达验证 | TcGAS, TcGAO, TcCOS | germacrene A synthase, germacrene A oxidase, costunolide synthase | 催化 | 农杆菌共渗透表达三个基因，检测到costunolide-半胱氨酸和costunolide-谷胱甘肽共轭物 |
关键发现
- 454测序获得484,392条reads，平均400 bp，装配成27,317个contigs和144,825条singletons；TcGAS与Tanacetum parthenium的GAS有95%氨基酸相似性，TcGAO与Cichorium intybus的GAO有88%相似性，TcCOS与C. intybus的COS有89%相似性；在烟草中瞬时表达TcGAS产生β-elemene（germacrene A的热重排产物）；酵母中共表达TcGAS和TcGAO产生γ-costic acid和β-costic acid（GAA的酸催化产物）；烟草中共表达TcGAS、TcGAO和TcCOS产生costunolide-半胱氨酸共轭物（m/z
- 1609）和costunolide-谷胱甘肽共轭物（m/z
- 2184），与理论分子式误差分别为6 ppm和22 ppm；除虫菊中STL最终浓度比除虫菊酯低5-10倍；RT-qPCR显示三个基因在腺毛中高表达，在幼苗中不表达，在花发育阶段1-5表达持续，阶段6-7下降。
研究结论
除虫菊中三个基因TcGAS、TcGAO和TcCOS共同催化从FDP经germacrene A和GAA到costunolide的级联反应，而GAA是所有已知除虫菊倍半萜内酯的中心前体；TcCOS催化的C6-α羟基化对C7-C8型STLs的形成亦至关重要，但催化C8-α羟基化的P450酶尚未鉴定。