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Synechocystis sp. PCC 6803 CruA (sll0147) encodes lycopene cyclase and requires bound chlorophyll a for activity

作者
Wei Xiong, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant
单位
Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University; Department of Chemistry and Biochemistry, Montana State University
杂志
Photosynthesis Research（2017）
DOI
10.1007/s11120-016-0316-0
所属领域
代谢工程
关键词
CarotenogenesisCarotenoidsChlorophyllLycopene cyclasePhotosynthesisβ-Carotene
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解决的核心问题

阐明Synechocystis sp. PCC 6803的cruA基因（sll0147）是否编码番茄红素环化酶，以及为什么该蛋白在E. coli中异源表达时无活性。

研究策略

构建Synechococcus sp. PCC 7002的cruA完全缺失突变体，通过异源表达、互补实验、金属亲和纯化、LDS-PAGE、质谱鉴定及体外酶活测定，证明CruA6803的番茄红素环化酶活性并揭示其结合叶绿素a。

研究路线图

100%
研究问题：阐明 Synechocystis cruA 是否编码番茄红素环化酶及其无活性原因
策略：构建 PCC 7002 cruA 敲除株，结合异源表达与生化分析
关键改造 1：互补实验恢复野生型表型，体内验证功能
关键改造 2：纯化 CruA6803 并鉴定色素结合
结果 1：体内表型恢复，色素谱与β-胡萝卜素含量恢复
结果 2：每分子蛋白结合 1.01 个叶绿素 a 和 0.32 个 β-胡萝卜素
结果 3：体外酶活随蛋白浓度增加，催化番茄红素生成 β-胡萝卜素
结论：sll0147 编码需结合叶绿素 a 才具活性的番茄红素环化酶
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核心内容

该研究通过构建Synechococcus sp. PCC 7002的cruA完全缺失突变体，结合异源表达、互补实验、金属亲和纯化及体外酶活测定，从生化水平首次证明Synechocystis sp. PCC 6803的sll0147（cruA）基因编码番茄红素环化酶。cruA缺失突变体表现出生长缓慢和光敏感，积累1-OH-番茄红素、番茄红素和γ-胡萝卜素，β-胡萝卜素含量约为野生型的一半。纯化的CruA6803蛋白呈黄绿色，每多肽平均结合1.01±0.25个叶绿素a和0.32±0.19个β-胡萝卜素。体外实验显示，以番茄红素为底物时，0.4 mg/mL酶产生Δβ-胡萝卜素1.55 ng，0.8 mg/mL酶产生3.08 ng；以γ-胡萝卜素为底物时，1.0 mg/mL酶产生约35.2 ng和36.0 ng的Δβ-胡萝卜素。该酶必须结合叶绿素a才具有活性，这解释了其在不能合成叶绿素a的大肠杆菌中异源表达无活性的现象，并提示叶绿素a可能作为辅因子协调叶绿素与类胡萝卜素两条生物合成通路，CruA是主要环化酶，CruP仅起辅助作用。

创新点

首次从生化水平证明Synechocystis sp. PCC 6803的CruA（sll0147）是番茄红素环化酶；发现该酶结合叶绿素a和β-胡萝卜素，且需要结合叶绿素a才具有活性；提出叶绿素a可能作为辅因子协调叶绿素与类胡萝卜素生物合成的调控机制。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Synechocystis sp. PCC 6803 类胡萝卜素生物合成 sll0147 (cruA) CruA6803 催化 番茄红素环化酶，催化番茄红素生成γ-胡萝卜素和β-胡萝卜素，需要结合叶绿素a才有活性
Synechococcus sp. PCC 7002 类胡萝卜素生物合成 cruA, cruP CruA, CruP 催化 cruA为主要的番茄红素环化酶，cruP为旁系同源物，可能作为辅助环化酶
Escherichia coli 类胡萝卜素生物合成 cruA6803 CruA6803 催化 异源表达产生77 kDa蛋白，但因缺乏叶绿素a而无环化酶活性
Synechococcus sp. PCC 7002 (ΔcruA::aacC1突变体) 类胡萝卜素生物合成 cruA6803 CruA6803 催化 互补实验验证了其功能，恢复野生型表型和β-胡萝卜素含量

关键发现

  1. cruA缺失突变体生长缓慢、光敏感，积累1-OH-番茄红素、番茄红素和γ-胡萝卜素，β-胡萝卜素含量约为野生型的一半
  2. 表达cruA6803的E. coli菌株中无环化酶活性，但互补Synechococcus sp. PCC 7002 cruA突变体后恢复野生型表型
  3. 纯化的CruA6803呈黄绿色，结合叶绿素a（平均每多肽1.01±0.25个）和β-胡萝卜素（平均每多肽0.32±0.19个）
  4. 体外酶活实验表明，以番茄红素为底物时，0.4 mg/mL酶产生Δβ-胡萝卜素1.55 ng，0.8 mg/mL酶产生3.08 ng
  5. 以γ-胡萝卜素为底物时，1.0 mg/mL酶产生Δβ-胡萝卜素35.2 ng和36.0 ng。

研究结论

Synechocystis sp. PCC 6803的sll0147编码番茄红素环化酶（CruA），该酶需要结合叶绿素a才具有活性，E. coli中无法合成叶绿素a因此异源表达无活性；CruA是主要的番茄红素环化酶，CruP可能起辅助作用。