Metabolic engineering of novel ketocarotenoid production in carrot plants
- 作者
- Jayaraman Jayaraj, Robert Devlin, Zamir Punja
- 杂志
- Transgenic Research（2007）
- DOI
- 10.1007/s11248-007-9120-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决在植物中高效生产酮类胡萝卜素（尤其是虾青素）的问题，探索利用高β-胡萝卜素含量的胡萝卜储藏根作为生物制造宿主，实现商业可行的酮类胡萝卜素积累。
研究策略
从雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）中克隆β-胡萝卜素酮化酶基因bkt1，融合豌豆Rubisco小亚基转运肽以靶向质体，利用双CaMV 35S、拟南芥泛素和RolD等不同启动子驱动，通过农杆菌介导法转化高胡萝卜素胡萝卜品系HCM，并利用内源β-胡萝卜素羟化酶的上调实现酮类胡萝卜素合成。
核心内容
本研究从雨生红球藻中克隆β-胡萝卜素酮化酶基因bkt1，融合豌豆Rubisco小亚基转运肽以靶向质体，在双CaMV 35S、拟南芥泛素和RolD等不同启动子驱动下，通过农杆菌介导法转化高β-胡萝卜素胡萝卜品系HCM，利用内源β-胡萝卜素羟化酶的上调实现酮类胡萝卜素合成。转基因胡萝卜根中总类胡萝卜素的70%转化为新型酮类胡萝卜素，总酮类胡萝卜素最高积累量达2400 μg/g干重，其中主要产物为虾青素（91.6 μg/g鲜重）、阿多尼红素（57.0 μg/g鲜重）和角黄素（50.1 μg/g鲜重）；转基因根中β-胡萝卜素水平降至野生型的34%，α-胡萝卜素和叶黄素也显著降低。大肠杆菌互补实验证实BKT1可将90-100%的β-胡萝卜素底物转化为角黄素和echinenone，在产生玉米黄质的大肠杆菌中可将95-100%底物转化为虾青素。结果表明胡萝卜储藏根是酮类胡萝卜素生物制造的适宜宿主，为功能性食品和水产养殖业提供了新的植物来源。
创新点
首次在重要根类作物（胡萝卜）中实现高达70%的β-胡萝卜素向酮类胡萝卜素转化，总酮类胡萝卜素积累量最高达2400 μg/g干重，为当时报道的最高水平；证明胡萝卜适合作为酮类胡萝卜素生物制药（biopharming）的宿主。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Daucus carota L. (胡萝卜，高胡萝卜素品系HCM) | 类胡萝卜素生物合成/酮类胡萝卜素合成 | bkt1 (β-胡萝卜素酮化酶) | BKT1蛋白 | 催化 | 来自雨生红球藻Haematococcus pluvialis，编码β-胡萝卜素C-4酮化酶，将β-胡萝卜素转化为角黄素等酮类胡萝卜素 |
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素合成（pACCAR25Δ-crtX / pACCAR16Δ-crtX） | bkt1 | BKT1蛋白 | 催化 | 用于细菌互补实验验证bkt功能，将β-胡萝卜素/玉米黄质转化为酮类胡萝卜素 |
| Daucus carota L. (胡萝卜) | 类胡萝卜素生物合成 | chyB (β-胡萝卜素羟化酶) | CHYB蛋白 | 催化 | 来自拟南芥Arabidopsis thaliana，用于共转化尝试，但内源羟化酶上调使得异源表达非必需 |
| Daucus carota L. (胡萝卜) | 类胡萝卜素生物合成 | DC-Chy1 (GenBank DQ192193) 和 DC-Chy2 (GenBank DQ192194) | 内源β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 转基因植株中表达显著上调，负责将β-胡萝卜素羟化生成玉米黄质等 |
| Daucus carota L. (胡萝卜) | 类胡萝卜素生物合成 | bar | 草丁膦乙酰转移酶 | 调控 | 作为选择标记基因，赋予转基因植株对草丁膦(Liberty)的抗性 |
| Daucus carota L. (胡萝卜) | 叶绿体/有色体蛋白质转运 | Rubisco小亚基转运肽(TP) | 转运肽 | 区室化 | 将BKT蛋白靶向到叶绿体和有色体，实现正确加工与定位 |
关键发现
- 转基因胡萝卜根中总类胡萝卜素的70%转化为新型酮类胡萝卜素，最高积累量达2400 μg/g干重（平均250 μg/g鲜重，范围230-270 μg/g）
- 主要酮类产物为虾青素（91.6 μg/g鲜重）、阿多尼红素（57.0 μg/g鲜重）和角黄素（50.1 μg/g鲜重），另有echinenone、adonixanthin和β-隐黄质
- 转基因根中β-胡萝卜素水平为野生型的34%，α-胡萝卜素和叶黄素显著降低
- 细菌互补实验中，bkt在产生β-胡萝卜素的大肠杆菌中使90-100%底物转化为角黄素和echinenone，在产生玉米黄质的大肠杆菌中使95-100%底物转化为虾青素
- chyB在β-胡萝卜素大肠杆菌中使90-100%底物转化为玉米黄质和β-隐黄质。
研究结论
胡萝卜储藏根天然积累高水平的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，适合作为酮类胡萝卜素生物制造的宿主。通过表达雨生红球藻bkt基因并利用内源羟化酶上调，可在胡萝卜根中高效积累虾青素等酮类胡萝卜素，为功能性食品、营养保健品和水产养殖业提供新的植物来源。