Biosynthesis of Sandalwood Oil: Santalum album CYP76F Cytochrome P450 Produce Santalols and Bergamotol
- 作者
- Maria L. Diaz-Chavez, Jessie Moniodis, Lufiani L. Madilao, Sharon Jancsik, Christopher I. Keeling, Elizabeth L. Barbour, Emilio L. Ghisalberti, Julie A. Plummer, Christopher G. Jones, Jörg Bohlmann
- 单位
- 英属哥伦比亚大学迈克尔·史密斯实验室，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大; 西澳大学植物生物学学院，克劳利，西澳大利亚州，澳大利亚; 西澳大学化学与生物化学学院，克劳利，西澳大利亚州，澳大利亚
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0075053
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明檀香（Santalum album）中檀香醇和佛手柑醇生物合成的关键氧化步骤，特别是催化檀香烯和佛手柑烯羟化反应的细胞色素P450酶，并为通过异源代谢工程生产檀香油成分奠定基础。
研究策略
挖掘檀香转录组中的P450候选基因，克隆并命名十个CYP76F亚家族成员；在酵母中表达这些P450与CPR，通过体外微体酶活测定和酵母体内代谢工程验证其功能，并检测底物特异性及酶动力学参数。
核心内容
该研究从檀香转录组中挖掘并克隆了十个CYP76F亚家族细胞色素P450候选基因，其中九个在酵母中成功功能表达。通过体外微体酶活测定和酵母体内代谢工程验证，发现Clade I成员如SaCYP76F39v1可催化檀香烯和佛手柑烯的羟基化，产生包括α-、β-、epi-β-檀香醇及α-exo-佛手柑醇在内的八种倍半萜醇异构体；而Clade II成员如SaCYP76F37v1则主要生成(E)-α-exo-佛手柑醇及微量檀香醇。酶动力学分析显示SaCYP76F39v1对α-檀香烯的表现Km为25.92 μM，kcat为1.12 s⁻¹，催化效率达4.3×10⁴ s⁻¹M⁻¹，高于Clade II酶。最终在酵母中共同表达SaSSy、SaCPR2和SaCYP76F39v1，实现了从FPP到檀香油特征倍半萜醇的完整异源合成，证明了该途径的可行性。这一工作不仅阐明了檀香油约90%成分（α-、β-、epi-β-檀香醇和α-exo-佛手柑醇）生物合成的关键氧化步骤，也为通过微生物发酵生产檀香油替代天然采伐提供了概念验证和酶学基础。
创新点
首次鉴定了檀香CYP76F亚家族P450酶，其中九个具有催化活性；明确了Clade I和Clade II在产物谱上的差异；在酵母中重建了从FPP到檀香醇和佛手柑醇的生物合成途径，实现概念验证。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F37v1 | SaCYP76F37v1 | 催化 | Clade II，主产(E)-α-exo-佛手柑醇，对α-和β-檀香烯具有氧化活性 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F37v2 | SaCYP76F37v2 | 催化 | Clade II，与SaCYP76F37v1同源，产物谱类似 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F38v1 | SaCYP76F38v1 | 催化 | Clade II，主要产生(E)-α-exo-佛手柑醇 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F38v2 | SaCYP76F38v2 | 催化 | Clade II，产物谱与SaCYP76F38v1类似 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F39v1 | SaCYP76F39v1 | 催化 | Clade I，广谱氧化檀香烯和佛手柑烯，产生8种倍半萜醇，动力学性质详细表征 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F39v2 | SaCYP76F39v2 | 催化 | Clade I，产物谱与SaCYP76F39v1相似 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F40 | SaCYP76F40 | 催化 | Clade I，主产物为(E)-α-exo-佛手柑醇和(E)-β-檀香醇 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F41 | SaCYP76F41 | 催化 | Clade I，产物谱类似其他Clade I成员 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F42 | SaCYP76F42 | 催化 | Clade I，产物谱类似SaCYP76F40 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCYP76F43 | SaCYP76F43 | 催化 | 在酵母中表达量低，未检测到功能活性 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCPR1 | SaCPR1 | 催化 | NADPH依赖性细胞色素P450还原酶，为P450提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaCPR2 | SaCPR2 | 催化 | NADPH依赖性细胞色素P450还原酶，与SaCPR1有70%氨基酸一致性，功能上可互换 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaSSy | SaSSy (santalene synthase) | 催化 | 倍半萜合酶，催化FPP生成α-、β-、epi-β-檀香烯和α-exo-佛手柑烯 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 檀香油倍半萜醇生物合成途径 | SaFPPS | SaFPPS (farnesyl diphosphate synthase) | 催化 | 法尼基焦磷酸合酶，催化IPP和DMAPP生成FPP |
关键发现
- 檀香油约90%由α-、β-、epi-β-檀香醇和α-exo-佛手柑醇组成
- 从转录组中克隆了10个CYP76F基因，其中9个功能表达
- Clade I P450（如SaCYP76F39v1）可产生8种倍半萜醇异构体，而Clade II（如SaCYP76F37v1）主要产生(E)-α-exo-佛手柑醇及微量(E)-α-檀香醇和(E)-β-檀香醇
- SaCYP76F39v1对α-檀香烯的表观Km为25.92 μM，kcat为1.12 s⁻¹，kcat/Km为4.3×10⁴ s⁻¹M⁻¹，对β-檀香烯的Km为34.82 μM，kcat为1.17 s⁻¹，kcat/Km为3.3×10⁴ s⁻¹M⁻¹
- SaCYP76F37v1对α-檀香烯的Km为133 μM，kcat为0.2 s⁻¹，对β-檀香烯的Km为157 μM，kcat为0.13 s⁻¹
- 微体制备中P450含量为0.2–1.6 μM
- 在酵母中共表达SaSSy、SaCPR2和SaCYP76F39v1可产生8种檀香醇/佛手柑醇，证明异源合成可行性。
研究结论
檀香CYP76F家族P450催化檀香烯和佛手柑烯末端烯丙基甲基的羟基化，产生檀香油的特征倍半萜醇；Clade I和Clade II在底物和立体选择性上存在差异；在酵母中重建该途径为沙棘油成分的微生物生产提供了理论基础和概念验证。