Construction of transplastomic lettuce (Lactuca sativa) dominantly producing astaxanthin fatty acid esters and detailed chemical analysis of generated carotenoids
- 作者
- Hisashi Harada, Takashi Maoka, Ayako Osawa, Jun-ichiro Hattan, Hirosuke Kanamoto, Kazutoshi Shindo, Toshihiko Otomatsu, Norihiko Misawa
- 单位
- Ishikawa Prefectural University; KNC Laboratories Co., Ltd.; Tottori University; Research Institute for Production Development; Japan Women's University
- 杂志
- Transgenic Research（2013）
- DOI
- 10.1007/s11248-013-9750-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在可食用植物中高效合成虾青素及其脂肪酸酯，并对生成的类胡萝卜素进行结构鉴定，以开发富含虾青素酯的功能性食品原料。
研究策略
利用叶绿体基因组转化技术，将海洋细菌来源的β,β-胡萝卜素3,3'-羟化酶基因(crtZ)、β,β-胡萝卜素4,4'-酮醇酶基因(crtW)以及异戊烯基二磷酸异构酶基因(idi)定点整合到生菜叶绿体基因组rbcL-accD位点，通过同源重组和光谱筛选获得稳定转化株，并结合HPLC、质谱、NMR和CD分析类胡萝卜素组成与结构。
核心内容
该研究利用叶绿体基因组转化技术，将海洋细菌来源的β,β-胡萝卜素3,3'-羟化酶基因（crtZ）、4,4'-酮醇酶基因（crtW）及异戊烯基二磷酸异构酶基因（idi）定点整合至生菜叶绿体基因组rbcL-accD位点，获得稳定遗传的转化株。通过HPLC、质谱、NMR和CD等手段对叶片类胡萝卜素进行详细结构鉴定，首次在转化植物中确认虾青素脂肪酸酯（肉豆蔻酸酯和棕榈酸酯）的结构。结果显示，T1代叶片总类胡萝卜素含量达230 μg/g鲜重，其中虾青素二酯占49.2%、单酯占18.2%、游离虾青素占10.0%，人工酮类胡萝卜素合计达94.9%，天然类胡萝卜素仅剩lactucaxanthin和lutein。转化株种子萌发率（98.8%）与野生型（93.1%）相当，单线态氧淬灭IC50值（8.1 μM）接近纯品虾青素（7.6 μM），远优于野生型（42.1 μM）。该工作实现了在可食用植物叶片中优势积累虾青素脂肪酸酯，为功能性食品和饲料开发提供了新原料，也为类胡萝卜素光保护机制研究建立了理想模型。
创新点
首次在转基因或叶绿体转化植物中结构鉴定了虾青素脂肪酸酯（肉豆蔻酸酯和棕榈酸酯）；通过叶绿体转化使虾青素酯在生菜叶片中优势积累（二酯+单酯占67.4%）；人工酮类胡萝卜素占总类胡萝卜素的94.9%，且转化株仍能正常生长结实。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Lactuca sativa cv. Berkeley（叶绿体） | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | CrtZ | 催化 | 来自海洋细菌Brevundimonas sp. SD212，编码β,β-胡萝卜素3,3'-羟化酶，催化β-胡萝卜素羟基化生成玉米黄质 |
| Lactuca sativa cv. Berkeley（叶绿体） | 类胡萝卜素生物合成 | crtW | CrtW | 催化 | 来自海洋细菌Brevundimonas sp. SD212，编码β,β-胡萝卜素4,4'-酮醇酶（4,4'-氧合酶），催化β-胡萝卜素及其衍生物的4,4'位酮基化 |
| Lactuca sativa cv. Berkeley（叶绿体） | 类胡萝卜素生物合成 | idi | Idi | 催化 | 来自海洋细菌Paracoccus sp. N81106，编码异戊烯基二磷酸异构酶（IPP异构酶），催化IPP与DMAPP异构化，增强类胡萝卜素前体供应 |
关键发现
- 构建的叶绿体转化生菜（T1）叶片总类胡萝卜素含量为230 μg/g FW
- 虾青素二酯占49.2%、单酯占18.2%、游离虾青素占10.0%，其他酮类胡萝卜素占17.5%，人工酮类胡萝卜素合计94.9%
- 天然类胡萝卜素仅剩lactucaxanthin（3.8%）和lutein（1.3%）
- T0代种子萌发率98.8%（野生型93.1%）
- 单线态氧淬灭IC50值为8.1 μM（野生型42.1 μM，参照虾青素7.6 μM）
- 虾青素二酯中二肉豆蔻酸酯:肉豆蔻酰棕榈酸酯:二棕榈酸酯=19:47:34，单酯中肉豆蔻酸酯:棕榈酸酯=45:55。
研究结论
成功构建了可稳定遗传的叶绿体转化生菜，其叶片主要积累虾青素脂肪酸酯（67.4%），人工酮类胡萝卜素达94.9%，总类胡萝卜素230 μg/g FW，可作为新型虾青素和其他酮类胡萝卜素供给的功能性食品或饲料候选，也可作为研究类胡萝卜素光保护作用的模型植物。