Combining Genotype Improvement and Statistical Media Optimization for Isoprenoid Production in E. coli
- 作者
- Congqiang Zhang, Xixian Chen, Ruiyang Zou, Kang Zhou, Gregory Stephanopoulos, Heng-Phon Too
- 单位
- Chemical and Pharmaceutical Engineering, Singapore-MIT Alliance, Singapore, Singapore; Department of Biochemistry, National University of Singapore, Singapore, Singapore; Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, United States of America
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0075164
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中异戊二烯类化合物（番茄红素、amorpha-1,4-diene）产量低，主要受DXP途径前体磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）供给不足限制；敲除PTS系统虽可提高PEP浓度但导致细胞生长严重受损。
研究策略
敲除大肠杆菌ptsHrr操纵子以增加细胞内PEP浓度，利用部分因子设计和响应面法系统优化培养基成分（甘油、KH2PO4等）及培养条件（温度、转速），在提高细胞密度的同时显著提升异戊二烯产量，并验证该方法对C15和C40异戊二烯的普适性。
核心内容
该研究通过敲除大肠杆菌PTS系统相关基因（ptsHrr操纵子）以增加细胞内磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）供给，并结合统计培养基优化策略，系统提升了异戊二烯类化合物（番茄红素和amorpha-1,4-diene）的产量。研究发现，PTS突变株在优化培养基OPT1（含50 g/L甘油、24 g/L KH2PO4）中番茄红素比产率较野生型提高7倍，最高达20,000 μg/g DCW，为当时报道的最高值；转速提高至300 rpm后进一步促进产量提升。转录和代谢组学分析显示，突变株中dxs和crtE等关键基因转录水平上调4–8倍，且质粒拷贝数增加，但培养基优化还通过延长指数期等机制进一步增产。该方法同样适用于C15异戊二烯，amorpha-1,4-diene产量达182 mg/L，显著高于对照。结果表明，将基因型改良与统计培养基优化相结合是一种普适性策略，可有效克服前体供给和细胞生长之间的矛盾，为大肠杆菌中异戊二烯类化合物的高效生产提供了可行途径。
创新点
首次将PTS敲除与统计培养基优化相结合用于大肠杆菌异戊二烯生产；实现了迄今报道的最高番茄红素比产率（20,000 μg/g DCW）；通过转录和代谢组学分析揭示了产量提升的部分机制；证明该方法可推广至其他异戊二烯类产物（amorpha-1,4-diene）。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli MG1655 (K-12) | 糖转运（PTS系统） | ptsH | HPr | 转运 | PTS组分，敲除ptsHrr操纵子以增加PEP供给 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 糖转运（PTS系统） | ptsI | PTS Enzyme I | 转运 | PTS组分，敲除ptsHrr操纵子 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 糖转运（PTS系统） | crr | PTS Enzyme IIA (EIIAGlc) | 转运 | PTS组分，敲除ptsHrr操纵子 |
| E. coli MG1655 (K-12) | DXP途径 | dxs | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase | 催化 | DXP途径限速酶，pBAD-SIDF质粒过表达 |
| E. coli MG1655 (K-12) | DXP途径 | idi | Isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | pBAD-SIDF质粒过表达 |
| E. coli MG1655 (K-12) | DXP途径 | ispD | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase | 催化 | 与ispF组成操纵子，pBAD-SIDF质粒过表达 |
| E. coli MG1655 (K-12) | DXP途径 | ispF | 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase | 催化 | 与ispD组成操纵子，pBAD-SIDF质粒过表达 |
| E. coli MG1655 (K-12) | DXP途径 | ispE | 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase | 催化 | 内源基因，转录分析参考基因之一 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 番茄红素合成途径 | crtE | Geranylgeranyl pyrophosphate synthase | 催化 | pAC-LYC或pACM-LYC质粒表达 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 番茄红素合成途径 | crtB | Phytoene synthase | 催化 | pAC-LYC或pACM-LYC质粒表达 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 番茄红素合成途径 | crtI | Phytoene desaturase | 催化 | pAC-LYC或pACM-LYC质粒表达 |
| E. coli MG1655 (K-12) | amorpha-1,4-diene合成途径 | ADS | Amorpha-1,4-diene synthase | 催化 | pAC-ADS质粒表达，催化FPP生成amorpha-1,4-diene |
| E. coli MG1655 (K-12) | 甘油代谢 | glpF | Glycerol facilitator | 转运 | 甘油摄取通道 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 甘油代谢 | glpK | Glycerol kinase | 催化 | 甘油磷酸化 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 甘油代谢 | glpD | Glycerol-3-phosphate dehydrogenase | 催化 | G3P转化为DHAP |
| E. coli MG1655 (K-12) | 糖酵解/糖异生 | ppsA | Phosphoenolpyruvate synthetase | 催化 | PEP合成相关，转录分析基因 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 糖酵解 | pykFA | Pyruvate kinase I and II | 催化 | PEP转化为丙酮酸，转录分析基因 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 回补途径 | ppc | PEP carboxylase | 催化 | PEP转化为草酰乙酸，转录分析基因 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 糖异生 | pck | PEP carboxykinase | 催化 | 草酰乙酸转化为PEP，转录分析基因 |
| E. coli MG1655 (K-12) | 糖酵解 | eno | Enolase | 催化 | 2-磷酸甘油酸转化为PEP，转录分析基因 |
关键发现
- 在优化条件下，PTS突变株（PTS01）的番茄红素产量比野生型（MG01）高7倍，最高比产率达到20,000 μg/g DCW（为至今报道的最高值）
- PTS01在葡萄糖培养基中比产率较MG01提高约3倍，但细胞密度极低
- 优化培养基OPT1（50 g/L甘油、24 g/L KH2PO4）中PTS01产量超过MG01两倍以上
- RSM模型预测产量16261 μg/g DCW，实验验证为17542±1105 μg/g DCW
- 转速由225 rpm提高至300 rpm后产量达约20,000 μg/g DCW
- PTS01在OPT1中dxs和crtE转录水平较2xPY培养基上调约4-8倍，且质粒拷贝数增加
- PTS03在优化培养基OPT2中amorpha-1,4-diene产量达182 mg/L，显著高于2xPY中的35.3 mg/L，且高于野生型MG02的136 mg/L。
研究结论
敲除PTS系统结合统计培养基优化可显著提高大肠杆菌异戊二烯类化合物（番茄红素和amorpha-1,4-diene）的产量，该方法具有普适性。转录上调关键生物合成基因（dxs-idi-ispDF和crtEBI）是必需但不充分的，培养基优化可能通过延长指数期等机制进一步提高产量。