Effect of biotin on transcription levels of key enzymes and glutamate efflux in glutamate fermentation by Corynebacterium glutamicum

作者: Yan Cao, Zuoying Duan, Zhongping Shi
杂志: World Journal of Microbiology and Biotechnology（2013）
DOI: 10.1007/s11274-013-1468-0
所属领域: 发酵工程
关键词: BiotinGlutamate fermentationGlutamate secretionTranscription levelTransport protein
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解决的核心问题

生物素对谷氨酸棒状杆菌谷氨酸发酵中关键酶转录水平和谷氨酸分泌的影响机制

研究策略

在不同初始生物素浓度及添加Tween 40的条件下，利用实时荧光定量PCR检测丙酮酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸代谢节点关键酶及谷氨酸转运蛋白的转录水平，同时监测发酵参数、胞内谷氨酸含量和细胞形态变化

研究路线图

100%

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核心内容

该研究以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为对象，系统考察了不同初始生物素浓度及添加Tween 40对谷氨酸发酵中关键酶转录水平和谷氨酸外排的影响。通过实时荧光定量PCR检测丙酮酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸代谢节点关键酶及谷氨酸转运蛋白的转录水平，同时监测发酵参数、胞内谷氨酸含量和细胞形态。结果发现，生物素不足时早期关键酶转录水平仅为对照的30%-50%，其中异柠檬酸脱氢酶在14 h仅为对照的2%，最终谷氨酸浓度仅64 g/L；生物素过量时异柠檬酸脱氢酶转录水平仅为对照的3%-22%，转运蛋白虽超对照10倍，但胞内谷氨酸仅1.5 mg/g DCW且无分泌；生物素过量并添加Tween 40后，32 h时转运蛋白转录水平为对照的22倍，α-酮戊二酸脱氢酶为17倍，胞内谷氨酸达10-12 mg/g DCW，最终产量达75-80 g/L。研究表明，谷氨酸过量生产需同时满足异柠檬酸脱氢酶上调、α-酮戊二酸脱氢酶下调及正常分泌功能，膜结构改变和谷氨酸转运蛋白对谷氨酸分泌缺一不可，这为发酵条件精准调控提供了分子层面的依据。

创新点

首次系统分析不同生物素水平和Tween 40添加对谷氨酸合成途径关键酶转录水平的影响，揭示ICDH低表达与谷氨酸分泌受阻的协同关系，证明膜结构改变和特异性转运蛋白对谷氨酸分泌缺一不可

研究对象（7）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Corynebacterium glutamicum ATCC13032	丙酮酸节点	pdh	丙酮酸脱氢酶 PDH	催化	催化丙酮酸氧化脱羧为乙酰-CoA
Corynebacterium glutamicum ATCC13032	丙酮酸节点	pc	丙酮酸羧化酶 PC	催化	催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸
Corynebacterium glutamicum ATCC13032	异柠檬酸节点	icdh	异柠檬酸脱氢酶 ICDH	催化	催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸，生物素不足或过量时转录水平显著降低
Corynebacterium glutamicum ATCC13032	异柠檬酸节点	icl	异柠檬酸裂解酶 ICL	催化	乙醛酸循环关键酶，催化异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸
Corynebacterium glutamicum ATCC13032	α-酮戊二酸节点	odhc	α-酮戊二酸脱氢酶复合体 ODHC	催化	催化α-酮戊二酸氧化脱羧进入TCA循环，其表达水平决定碳流走向
Corynebacterium glutamicum ATCC13032	α-酮戊二酸节点	gdh	谷氨酸脱氢酶 GDH	催化	催化α-酮戊二酸还原氨化生成谷氨酸
Corynebacterium glutamicum ATCC13032	谷氨酸分泌途径	tp	谷氨酸转运蛋白 TP	转运	可能为NCg/1221编码的谷氨酸外排载体，负责谷氨酸向胞外分泌

关键发现

['生物素不足时，早期生产阶段关键酶转录水平为对照的30-50%，其中ICDH在14 h仅为对照的2%，最终谷氨酸浓度仅64 g/L', '生物素过量时，ICDH转录水平仅为对照的3-22%，转运蛋白超过对照10倍以上，但胞内谷氨酸仅1.5 mg/g DCW，无谷氨酸分泌', '生物素过量并添加Tween 40后，32 h时TP转录水平为对照的22倍，ODHC为17倍，胞内谷氨酸达10-12 mg/g DCW，最终谷氨酸浓度达75-80 g/L', '异常批次中，32 h转运蛋白转录水平仅为对照的1%，即使膜结构改变和胞内谷氨酸较高，谷氨酸分泌也停止', '生物素不足时胞内谷氨酸在20 h前比对照低30-70%，20 h后维持对照水平2.5 mg/g DCW']

研究结论

谷氨酸过量生产需要同时满足icdh上调、odhc下调以及正常的谷氨酸分泌；膜结构改变和谷氨酸转运蛋白对谷氨酸分泌不可或缺，生物素和Tween 40通过影响ICDH表达和谷氨酸外排进而影响谷氨酸产量