Application and microbial preparation of D-valine
- 作者
- Ming Chen, Chao Shi, Jing Zhao, Ziqing Gao, Chunzhi Zhang
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s11274-016-2119-z
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
D-缬氨酸具有广泛工业应用价值，但其传统化学制备方法成本高、污染大，需要建立经济、高效、环境友好的微生物制备方法。
研究策略
综述了三种微生物制备D-缬氨酸的途径：微生物不对称降解DL-缬氨酸、D-氨基酰化酶立体选择性水解N-酰基-DL-缬氨酸、D-乙内酰脲酶偶联D-氨甲酰酶水解DL-5-异丙基乙内酰脲，并比较了各方法的优缺点。
核心内容
D-缬氨酸在药物合成和精细化工领域应用广泛，但传统化学法制备成本高且污染严重。该文系统综述了微生物法制备D-缬氨酸的三种主要途径：微生物不对称降解DL-缬氨酸、D-氨基酰化酶立体选择性水解N-酰基-DL-缬氨酸，以及乙内酰脲酶偶联D-氨甲酰酶水解DL-5-异丙基乙内酰脲。不同菌株表现出差异化的催化性能：Candida maltosa DLPU-zpb可在72小时内完全降解50 g/L DL-缬氨酸中的L-异构体，而Defluviabacter sp. A131-3的D-氨基酰化酶能在150 g/L底物条件下高效拆分N-乙酰-DL-缬氨酸。值得注意的是，重组大肠杆菌D9菌株在50 g/L底物下反应48小时，D-缬氨酸产率可达88%。对比分析表明，乙内酰脲酶途径因理论产率可达100%而最具工业吸引力，近年来重组全细胞催化和酶工程改造正进一步提升其应用潜力。该综述为D-缬氨酸的绿色生物制造提供了技术路径比较和优化方向参考。
创新点
系统比较了三种微生物制备方法，指出'乙内酰脲酶工艺'理论产率可达100%，并介绍了重组全细胞催化及酶工程改造方面的进展。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Proteus vulgaris IAM 12003 | DL-缬氨酸不对称降解 | — | — | 催化 | 选择性降解L-缬氨酸，72 h后D-缬氨酸产率36% |
| Candida maltosa DLPU-zpb | DL-缬氨酸不对称降解 | — | L-缬氨酸氨基转移酶（推测） | 催化 | 在30°C、pH 6.0、50 g/L DL-缬氨酸条件下72 h内完全降解L-异构体 |
| Defluviabacter sp. A131-3 | N-乙酰-DL-缬氨酸水解 | — | D-氨基酰化酶 | 催化 | 对N-乙酰-D-缬氨酸活性高，30°C、pH 8.0、150 g/L底物下高效拆分 |
| Alcaligenes xylosoxydans A-6 | N-酰基-D-氨基酸水解 | — | D-氨基酰化酶（AxDNAase） | 催化 | 商业酶，但N-乙酰-D-缬氨酸活性低，经定点突变改造 |
| Agrobacterium radiobacter | 乙内酰脲酶途径 | — | D-乙内酰脲酶、D-氨甲酰酶、乙内酰脲消旋酶 | 催化 | 静息细胞转化DL-5-异丙基乙内酰脲，40°C、pH 7.5、100 g/L底物，48 h后残留6.8% |
| Escherichia coli（重组） | 乙内酰脲酶途径 | 来自Agrobacterium radiobacter NRRL B11291的D-乙内酰脲酶和D-氨甲酰酶基因，来自Agrobacterium tumefaciens C58的乙内酰脲消旋酶基因 | D-乙内酰脲酶、D-氨甲酰酶、乙内酰脲消旋酶 | 催化 | Martinez-Rodriguez等构建，完全转化DL-5-单取代乙内酰脲 |
| Escherichia coli（重组株D9） | 乙内酰脲酶途径 | 来自Flavobacterium sp. AJ11199的D-乙内酰脲酶和D-氨甲酰酶基因，来自Microbacterium liquefaciens AJ3912的乙内酰脲消旋酶基因 | D-乙内酰脲酶、D-氨甲酰酶、乙内酰脲消旋酶 | 催化 | Nozaki等构建，50 g/L DL-5-异丙基乙内酰脲下48 h D-缬氨酸产率88% |
| Escherichia coli（重组） | 乙内酰脲酶途径 | 来自Agrobacterium tumefaciens的乙内酰脲酶过程基因（多顺反子结构） | D-乙内酰脲酶、D-氨甲酰酶、乙内酰脲消旋酶 | 催化 | Martinez-Gomez等构建，D-氨甲酰酶基因最靠近启动子以提高活性 |
| Streptomyces（放线菌素D生产者） | 放线菌素D生物合成 | — | 放线菌素合成酶II | 催化 | 催化L-缬氨酸差向异构为D-缬氨酸 |
| 哺乳动物细胞（如成纤维细胞） | D-缬氨酸代谢 | — | D-氨基酸氧化酶 | 催化 | 将D-缬氨酸转化为L-缬氨酸，用于细胞培养选择性抑制成纤维细胞增殖 |
关键发现
- Proteus vulgaris IAM 12003选择性降解L-缬氨酸，72 h后D-缬氨酸产率为36%；Candida maltosa DLPU-zpb在30°C、pH
- 0、50 g/L DL-缬氨酸条件下72 h内完全降解L-异构体；Defluviabacter sp. A131-3的D-氨基酰化酶在30°C、pH
- 0、150 g/L N-乙酰-DL-缬氨酸底物下高效拆分；Alcaligenes xylosoxydans A-6的D-氨基酰化酶突变体F191W和L298A对N-乙酰-D-色氨酸催化效率提高，但对N-乙酰-D-缬氨酸活性仍低；Agrobacterium radiobacter静息细胞在40°C、pH
- 5、100 g/L DL-5-异丙基乙内酰脲下反应48 h后仅残留6.8%乙内酰脲；重组E. coli（Nozaki等）D9菌株在50 g/L DL-5-异丙基乙内酰脲下48 h D-缬氨酸产率达88%。
研究结论
微生物制备D-缬氨酸具有高立体选择性、反应条件温和、环境友好等优势，其中'乙内酰脲酶工艺'理论产率可达100%，是最具吸引力的方法；未来结合高通量筛选和蛋白质工程可进一步提升工业应用潜力。