Studies on the production of shikimic acid using the aroK knockout strain of Bacillus megaterium
- 作者
- Saptarshi Ghosh, Utpal Mohan, Uttam Chand Banerjee
- 单位
- Department of Pharmaceutical Technology (Biotechnology), National Institute of Pharmaceutical Education and Research, Sector 67, S. A. S. Nagar, Mohali, Punjab 160062, India; Department of Biotechnology, National Institute of Pharmaceutical Education and Research, Guwahati Medical College and Hospital, Guwahati, Assam 781032, India
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s11274-016-2092-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过敲除巨大芽孢杆菌中的aroK基因（莽草酸激酶），阻断莽草酸向下游芳香族氨基酸合成途径的代谢流，从而积累莽草酸，提高其发酵产量。
研究策略
利用同源重组介导的基因敲除技术，构建携带33 bp aroK同源序列的氯霉素抗性基因（CmR）盒，转化巨大芽孢杆菌原生质体，实现aroK基因的插入失活；随后进行摇瓶培养、碳源优化和10 L生物反应器放大试验。
核心内容
本研究以巨大芽孢杆菌MTCC428为底盘细胞，通过同源重组敲除aroK基因（编码莽草酸激酶），阻断莽草酸向芳香族氨基酸合成途径的代谢流，从而积累目标产物莽草酸。具体策略是构建携带33 bp aroK同源序列的氯霉素抗性基因盒，转化原生质体实现插入失活，随后进行摇瓶培养、碳源优化及10 L生物反应器放大试验。结果显示，aroK敲除株摇瓶莽草酸产量为2.98 g/L，较野生型（0.53 g/L）提高约6倍；碳源优化发现4%（w/v）果糖时产量最高达4.94 g/L；10 L发酵罐中最大产量达6.02 g/L，约为野生型的12倍。动力学分析表明，产物得率系数Y_P/S为0.457，比产物形成速率q_P达0.37 h⁻¹，较野生型提高约7倍。该研究首次在巨大芽孢杆菌中实现aroK基因敲除，结合碳源优化与发酵放大有效提升了莽草酸产量，为微生物发酵生产莽草酸提供了可行的代谢工程策略。
创新点
['首次在巨大芽孢杆菌中通过同源重组敲除aroK基因', '利用33 bp同源臂的CmR基因盒实现高效基因置换', '系统优化碳源（果糖4% w/v）使莽草酸产量达4.94 g/L', '10 L发酵罐中莽草酸产量达6.02 g/L，较野生型提高约12倍']
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus megaterium MTCC428 | 莽草酸途径（芳香族氨基酸生物合成途径） | aroK | 莽草酸激酶（shikimate kinase） | 催化 | 通过同源重组敲除，使莽草酸无法转化为莽草酸-3-磷酸，从而积累莽草酸 |
关键发现
- 摇瓶水平aroK敲除株莽草酸产量为2.98 g/L，比野生型（0.53 g/L）提高约6倍
- 莽草酸激酶活性降至野生型的32%（正文结果中为35%）
- 以1%（w/v）果糖为碳源时莽草酸产量3.8 g/L，当果糖浓度为4%（w/v）时最高产量达4.94 g/L
- 10 L生物反应器中莽草酸最大产量为6.02 g/L（约12倍于野生型）
- 动力学参数：比生长速率μ=0.275 h^-1，细胞得率系数Y_X/S=0.337，比底物消耗速率q_S=0.81 h^-1，产物得率系数Y_P/S=0.457，比产物形成速率q_P=0.37 h^-1（较野生型0.05 h^-1提高约7倍）。
研究结论
aroK基因敲除有效阻断了莽草酸途径下游代谢，显著提高了巨大芽孢杆菌中莽草酸的积累，结合碳源优化和发酵放大可获得较高产量，为莽草酸的微生物发酵生产提供了潜力策略。