Impact of orientation and flexibility of peptide linkers on \(T\) . maritima lipase Tm1350 displayed on Bacillus subtilis spores surface using CotB as fusion partner
- 作者
- Jawad Ullah, Huayou Chen, Ake Vastermark, Jinru Jia, Bangguo Wu, Zhong Ni, Yilin Le, Hongcheng Wang
- 单位
- Institute of Life Sciences, Jiangsu University; National Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences; Division of Biological Sciences, University of California at San Diego; Nitech
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s11274-017-2327-1
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
评估不同长度、柔性和取向的肽接头对以CotB为融合伴侣展示在枯草芽孢杆菌孢子表面的T. maritima脂肪酶Tm1350活性和稳定性的影响
研究策略
构建含10种不同肽接头（L1-L10）和无接头（L0）的CotB-Tm1350融合蛋白，展示在枯草芽孢杆菌DB403孢子表面，通过酶活测定分析温度、pH、蛋白酶和有机溶剂对展示酶的影响
核心内容
该研究在枯草芽孢杆菌孢子表面以CotB为融合伴侣展示海栖热袍菌来源的脂肪酶Tm1350，系统考察了十种不同长度、柔性与取向的肽接头（L1–L10）对展示酶催化性能的影响。作者构建了包含无接头对照（L0）的系列融合蛋白并测定酶活，结果显示接头设计显著改变酶性能：含柔性甘氨酸重复单元的长接头L9和L7在最优条件下酶活分别比无接头提高1.29倍和1.16倍；80°C处理5小时后，L3和L9残余活性分别为39.66%和38.41%，明显高于L0的28.41%。接头取向同样关键，L7活性比同系列L5和L6高1.27倍。在蛋白酶和有机溶剂耐受性测试中，L7经0.1%蛋白酶K处理后保留40.61%活性，L3经菠萝蛋白酶处理后保留70.05%活性，L4在30%甲醇中活性比原始酶高1.83倍。各展示酶最适pH为8.5–9.5，最适温度均为75°C。该工作表明，通过合理设计含柔性甘氨酸的接头并优化其取向，可有效提升孢子表面展示脂肪酶的活力与工业稳定性，为酶固定化策略提供了实用指导。
创新点
系统比较了肽接头长度、柔性和取向对孢子表面展示脂肪酶的影响，发现含柔性甘氨酸残基的长接头（如L9）能显著提高酶活和热稳定性，且接头取向（如L7优于L5/L6）对酶活有重要影响
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis DB403 | 孢子形成通路 | cotB | CotB | 区室化 | 作为锚定蛋白将Tm1350展示在孢子表面 |
| Thermotoga maritima MSB8 | 脂质水解 | tm1350 | Tm1350脂肪酶 | 催化 | 嗜热脂肪酶，通过CotB展示于枯草芽孢杆菌孢子表面 |
关键发现
- 在最佳温度和pH下，含L9[(GGGGS)4]和L7接头的融合酶活性分别比无接头提高1.29倍和1.16倍
- 在80°C孵育5h后，L3和L9残余活性分别比无接头高1.40倍和1.35倍（L3为39.66%，L9为38.41%，L0为28.41%）
- L7比L5和L6活性分别高1.05倍和1.27倍
- 在0.1%蛋白酶K处理后，L7剩余活性为40.61%，L2、L10等也有较高稳定性
- 在0.1%菠萝蛋白酶处理后，L3、L1和L2活性最高，分别为70.05%、67.15%和65.91%
- 在20%乙醇处理下，L1和L4保持61.57%和60.90%活性，比原始高1.34和1.32倍
- 在30%甲醇处理下，L4活性为54.93%，比原始高1.83倍
- 最适pH在8.5-9.5之间，不同接头略有差异
- 最适温度均为75°C
研究结论
肽接头的氨基酸组成、取向和长度显著影响孢子表面展示的Tm1350的酶活性和稳定性。含柔性甘氨酸的接头比含刚性丙氨酸的接头更有利于提高酶活和热稳定性，通过合理设计接头可改善展示酶在工业应用中的性能。