Artemisinin-based antimalarial research: application of biotechnology to the production of artemisinin, its mode of action, and the mechanism of resistance of Plasmodium parasites
- 作者
- Paskorn Muangphrom, Hikaru Seki, Ery Odette Fukushima, Toshiya Muranaka
- 杂志
- Journal of Natural Medicines（2016）
- DOI
- 10.1007/s11418-016-1008-y
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素在黄花蒿中含量低（0.01%~2%干重），供应不足；同时出现青蒿素耐药性疟原虫，威胁现有治疗策略。
研究策略
综述了多种提高青蒿素产量的策略：传统育种、农业技术、代谢工程（过表达/共表达/抑制竞争通路）、转录因子调控、异源微生物生产；并总结了青蒿素作用机制及耐药机制研究。
核心内容
该综述系统梳理了利用生物技术提高青蒿素产量及应对耐药性的研究进展。针对黄花蒿中青蒿素含量低（仅0.01%–2%干重）导致供应不足的问题，作者总结了传统育种、代谢工程、转录因子调控及异源生产等多条策略。在代谢工程方面，过表达FPS可使青蒿素产量提高2–3.6倍，共表达HMGR和ADS可提高7.65倍，而RNAi抑制竞争通路中的SQS也可提高3.14倍；异源生产方面，工程化大肠杆菌和酿酒酵母分别实现了27.4 g/L的amorphadiene和25 g/L的青蒿酸产量。此外，该文还梳理了青蒿素作用机制与耐药机制，指出K13螺旋桨结构域突变及PfPI3K水平升高与耐药性密切相关，并提出了ADS可能是青蒿素合成限速酶的观点。这些结果意味着通过多种生物技术手段可显著降低青蒿素生产成本，但耐药性威胁要求持续阐明其分子机制并开发新药。
创新点
梳理了非产青蒿素蒿属物种中CYP71AV1和DBR2直系同源物的功能研究，提出ADS可能是青蒿素合成的限速酶；总结了青蒿素耐药性关键分子标记K13-螺旋桨突变及PfPI3K的角色。
研究对象（32）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua | 甲羟戊酸(MVA)途径 | HMGR | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达HMGR可提高青蒿素产量，与FPS共表达提高1.8倍，与ADS共表达提高7.65倍。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | FPS | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP/DMAPP生成FPP，过表达使青蒿素产量提高2~3.6倍。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | ADS | 紫穗槐-4,11-二烯合酶 | 催化 | 催化FPP环化生成amorpha-4,11-diene，关键酶。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | CYP71AV1 | 紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶 | 催化 | 催化amorpha-4,11-diene的三步氧化生成青蒿酸。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | CPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | CYP71AV1的氧化还原伴侣，共表达提高青蒿素产量38%。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | DBR2 | 青蒿醛Δ11(13)还原酶 | 催化 | 催化青蒿醛还原为二氢青蒿醛，过表达提高青蒿素2倍、青蒿酸5.48~9.06倍。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | ALDH1 | 醛脱氢酶1 | 催化 | 氧化二氢青蒿醛为二氢青蒿酸，最后非酶促生成青蒿素。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | ADH1 | 醇脱氢酶1 | 催化 | 催化青蒿醇氧化为青蒿醛。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | RED1 | 二氢青蒿醛还原酶1 | 催化 | 还原二氢青蒿醛为二氢青蒿醇，可能分流代谢，沉默或可提高青蒿素。 |
| Artemisia annua | 甾醇生物合成 | SQS | 鲨烯合酶 | 催化 | 竞争甾醇途径，RNAi抑制后青蒿素提高3.14倍。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成调控 | AaWRKY1 | WRKY1转录因子 | 调控 | 上调HMGR、ADS、CYP71AV1、DBR2表达，过表达使CYP71AV1转录水平提高33倍。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成调控 | AaORA | AP2/ERF转录因子 | 调控 | 上调ADS、CYP71AV1、DBR2表达，促进青蒿素积累。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成调控 | AaERF1/AaERF2 | AP2/ERF转录因子 | 调控 | 结合ADS和CYP71AV1启动子，正调控青蒿素合成。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成调控 | AabZIP1 | bZIP转录因子 | 调控 | 结合ADS和CYP71AV1启动子的ABRE元件，上调相关基因。 |
| Artemisia annua | 植物激素信号 | AaPYL9 | ABA受体 | 调控 | 过表达提高ABA敏感性，促进青蒿素生物合成。 |
| Artemisia annua | 毛状体蜡质合成 | TFAR1 | 脂肪酰-CoA还原酶1 | 催化 | 参与腺毛扩张时角质层蜡质形成。 |
| Artemisia annua | 毛状体转运 | AaABCG6/AaABCG7 | ABCG转运蛋白 | 转运 | 参与毛状体角质层发育，可能运输青蒿素前体。 |
| Artemisia annua | 茉莉酸生物合成 | AaAOC | 丙二烯氧化物环化酶 | 催化 | MeJA处理上调其表达，促进JA合成间接提高青蒿素。 |
| Artemisia annua | 植物生长调控 | rolB/rolC | RolB/RolC蛋白 | 调控 | 来自发根农杆菌，提高腺毛密度和青蒿素含量（2~9倍和4倍）。 |
| Artemisia annua | 糖苷水解 | bgl1 | β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 来自里氏木霉，表达使花中腺毛密度提高66%，青蒿素提高5倍。 |
| Escherichia coli | 异源生产MVA途径 | MeVT operon (atoB-HMGS-HMGR) | 乙酰乙酰-CoA硫解酶/HMG-CoA合酶/HMG-CoA还原酶 | 催化 | 工程化MVA途径提高FPP供应，amorphadiene产量最高27.4 g/L。 |
| Escherichia coli | 青蒿素前体异源生产 | ADS | 紫穗槐-4,11-二烯合酶 | 催化 | 异源表达生产amorpha-4,11-diene，两相生物反应器提高至500 mg/L。 |
| Escherichia coli | 青蒿素前体氧化 | CYP71AV1 (engineered) | 工程化紫穗槐-4,11-二烯12-单加氧酶 | 催化 | 工程化N端跨膜域后，青蒿酸产量105 mg/L。 |
| Escherichia coli | 青蒿素前体氧化 | P450BM3 | 来自巨大芽孢杆菌的P450单加氧酶 | 催化 | 替代CYP71AV1生产青蒿素-11S,12-环氧化物，产量>250 mg/L。 |
| Saccharomyces cerevisiae | 异源生产MVA途径 | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 多拷贝整合，amorpha-4,11-diene产量达41 g/L。 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素前体氧化 | CYP71AV1, CPR, ADH1, ALDH1, CYB5 | 紫穗槐二烯单加氧酶/还原酶/醇脱氢酶/醛脱氢酶/细胞色素b5 | 催化 | 将amorpha-4,11-diene氧化为青蒿酸，产量25 g/L。 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素前体异源生产 | tHMGR, FPS, ADS, CYP71AV1 | 相应酶 | 催化 | 瞬时表达产生青蒿酸-12-β-二葡萄糖苷，产量39.5 mg/kg FW。 |
| tobacco chloroplast | 青蒿素前体异源生产 | atoB-HMGS-HMGR-MK-PMK-MVD1, IDI-FPS-ADS-CYP71AV1-CPR | MVA途径酶及青蒿素合成相关酶 | 催化 | 叶绿体表达青蒿酸产量0.1 mg/g FW。 |
| Plasmodium falciparum | 钙离子转运 | PfATP6 | 内质网Ca2+-ATP酶 | 转运 | 青蒿素的潜在靶点之一，但耐药性与其无明显关联。 |
| Plasmodium falciparum | 耐药机制 | K13 | Kelch螺旋桨蛋白 | 调控 | K13-螺旋桨结构域突变是青蒿素耐药性的关键分子标记。 |
| Plasmodium falciparum | 脂质信号 | PfPI3K | 磷脂酰肌醇-3-激酶 | 催化 | K13突变导致PfPI3K水平升高，与耐药性相关。 |
| Plasmodium falciparum | 多药耐药 | Pfmdr1 | 多药耐药蛋白1 | 转运 | 特定等位基因与青蒿素联合疗法治疗失败相关。 |
关键发现
- ['黄花蒿中青蒿素含量仅0.01%~2%干重，传统育种可将产量提高至>2%干重（如杂交种产量36.3~54.5 kg/ha）。', '在黄花蒿中过表达FPS使青蒿素产量提高2~3.6倍
- 共表达FPS、CYP71AV1和CPR提高3.6倍
- 共表达HMGR和ADS提高7.65倍
- RNAi抑制SQS提高3.14倍。', '过表达转录因子AaWRKY1使CYP71AV1转录水平提高33倍
- AaERF1/2和AabZIP1也能上调青蒿素生物合成基因。', '表达β-葡萄糖苷酶bgl1使花中腺毛密度提高66%，青蒿素产量提高5倍
- rolB和rolC分别提高青蒿素2~9倍和4倍。', '在烟草等植物中异源表达青蒿素前体基因，最高青蒿酸产量为39.5 mg/kg FW（烟草叶片）和0.1 mg/g FW（烟草叶绿体）。', '在E. coli中工程化MVA途径，最高amorphadiene产量达27.4 g/L
- 表达工程化P450BM3可产生>250 mg/L的青蒿素-11S,12-环氧化物。', '在酿酒酵母中通过代谢工程，青蒿酸产量最高达25 g/L，半合成青蒿素经优化后总收率40~45%，纯化回收率61.5%。', '青蒿素耐药性与PF3D7_1343700 kelch螺旋桨结构域（K13）突变有关，导致早期环状体阶段存活率增加，且耐药性与PfPI3K水平升高相关。']
研究结论
通过多种生物技术手段可显著提高青蒿素产量并降低成本，但青蒿素耐药性疟原虫的出现要求进一步理解其作用机制和耐药机制，并持续开发新药和优化治疗方案。