Evaluation of different glycerol fed-batch strategies in a lab-scale bioreactor for the improved production of a novel engineered \beta-fructofuranosidase enzyme in Pichia pastoris
- 作者
- Gerhardt Coetzee, Maria del Prado García-Aparicio, Catharine Elizabeth Bosman, Eugène van Rensburg, Johann Ferdinand Görgens
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Stellenbosch University
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s11274-024-04027-6
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
比较DO-stat和恒定流加两种甘油补料策略对毕赤酵母表达天然及工程化β-呋喃果糖苷酶的影响，以确定更适合工业生产的补料方式。
研究策略
在实验室规模生物反应器中，使用GAP启动子组成型表达两种fopA酶，分别采用DO-stat和恒定流加补料分批策略，监测生物量、酶活、生产率和发酵时间。
核心内容
本研究在实验室规模生物反应器中，以毕赤酵母组成型表达天然及工程化β-呋喃果糖苷酶，系统比较了DO-stat与恒定流加两种甘油补料分批策略的发酵性能。摇瓶阶段工程菌株GAPfopA_V1最高酶活达121.8 U/mL，较参考菌株提高约53.6%，但反应器放大后该优势消失。在生物反应器中，DO-stat策略下天然酶最高体积酶活为2129 U/mL，比工程酶高20.8%，但耗时155小时；恒定流加策略虽最高酶活略低（天然酶1413 U/mL），仅需59小时即可达到峰值，体积生产率达23.96×10³ U/L/h，约为DO-stat策略的1.7倍，且生物量浓度更高（DCW 133.9 g/L），生物量产率约2.2 g/L/h，可重复性显著优于DO-stat。结果表明，摇瓶筛选结果不能直接外推至反应器规模，恒定流加策略以更短时间获得接近的酶产量和更高的体积生产率，更适合该酶的工业化生产应用。
创新点
首次评估新型工程化β-呋喃果糖苷酶（GAPfopA_V1）在生物反应器中的生产性能；发现摇瓶筛选结果与反应器结果不一致；证明恒定流加策略在体积生产率和可重复性方面优于DO-stat。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris DSMZ 70382 (CBS704) | 甘油代谢（补料培养） | fopA | β-呋喃果糖苷酶 (FFase) | 催化 | 天然酶，催化蔗糖转糖基生成低聚果糖 |
| Pichia pastoris DSMZ 70382 (CBS704) | 甘油代谢（补料培养） | fopA_V1 | 工程化β-呋喃果糖苷酶（F140Y-A178P-G321N-Q490S） | 催化 | 新型工程酶，含四个氨基酸取代，摇瓶活性高于天然酶，但生物反应器中较低 |
| Pichia pastoris DSMZ 70382 (CBS704) | 糖酵解/甘油代谢 | GAP promoter (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter) | — | 调控 | 组成型强启动子，驱动fopA/fopA_V1表达 |
| Pichia pastoris DSMZ 70382 (CBS704) | 蛋白分泌通路 | xln2 | Trichoderma reesei endoxylanase 2信号肽 | 转运 | 融合分泌信号肽，引导重组酶分泌到胞外 |
关键发现
- 摇瓶筛选中，工程菌株G250.2（GAPfopA_V1）最高酶活121.8±6.0 U/mL，比参考菌株GAPfopA（79.3±4.93 U/mL）提高约53.6%。在生物反应器中，DO-stat策略下GAPfopA最高体积酶活2129.25±816.39 U/mL，比GAPfopA_V1（1686.91±212.29 U/mL）高20.8%；恒定流加策略下GAPfopA为1413.36±26.18 U/mL，比GAPfopA_V1（1222.70±135.69 U/mL）高13.5%。恒定流加策略体积生产率更高：GAPfopA为23.96±0.44×10^3 U/L/h，GAPfopA_V1为20.72±2.30×10^3 U/L/h；而DO-stat分别为13.74±5.27×10^3 U/L/h和10.88±1.37×10^3 U/L/h。恒定流加达到最高酶活仅需59h，DO-stat需155h。恒定流加生物量浓度更高（DCW
- 86±3.92 g/L vs
- 73±1.99 g/L），生物量产率约2.2 g/L/h vs
- 7 g/L/h，生物量得率0.55 g/g vs
- 49 g/g。批阶段最大比生长速率0.19–0.24 h^-1。
研究结论
成功在毕赤酵母中高滴度表达了天然和工程化β-呋喃果糖苷酶。DO-stat培养可获得更高的最大体积酶活，但过程时间长、DO控制差、可重复性差；恒定流加培养具有更高的体积酶生产率、更好的可重复性和接近的酶产量，更适合工业应用。