Efficient expression of single chain variable fragment antibody against paclitaxel using the Bombyx mori nucleopolyhedrovirus bacmid DNA system and its characterizations
- 作者
- Gorawit Yusakul, Seiichi Sakamoto, Hiroyuki Tanaka, Satoshi Morimoto
- 杂志
- Journal of Natural Medicines（2017）
- DOI
- 10.1007/s11418-016-0981-5
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
高效表达具有活性的抗紫杉醇单链抗体（scFv），以克服大肠杆菌系统中包涵体复性效率低的问题，并用于紫杉醇的免疫分析和毒性中和评价。
研究策略
构建VH-(GGGGS)5-VL形式的抗紫杉醇scFv基因，分别利用大肠杆菌pET28a(+)系统和家蚕BmNPV bacmid DNA系统进行表达，通过间接竞争ELISA表征其反应性和特异性，并比较两种表达系统的效果。
核心内容
本研究构建了抗紫杉醇单链抗体PT-scFv3A3（VH-(GGGGS)5-VL形式），分别利用大肠杆菌pET28a(+)系统和家蚕BmNPV bacmid DNA系统进行表达，并通过间接竞争ELISA比较两种系统的效果。在大肠杆菌中，该抗体以包涵体形式表达，从1 L培养物获得18.2 mg变性蛋白，但复性后活性极低，几乎无结合能力。相比之下，利用家蚕幼虫表达的scFv可分泌至血淋巴中，每只幼虫可纯化约240 μg活性蛋白，10只幼虫共获得2.41 mg，反应性远高于大肠杆菌复性产物。icELISA显示该抗体对紫杉醇的线性检测范围为0.156至5.00 μg/ml，对多西他赛为0.625至20.0 μg/ml。交叉反应性测试表明，该scFv对多西他赛、7-木糖基紫杉醇和头孢曼宁的交叉反应率分别为31.1%、22.1%和8.50%，对巴卡亭III等紫杉烷类前体均低于0.685%，整体低于其亲本单抗PT-MAb3A3，表现出更高的检测特异性。该研究首次利用BmNPV bacmid DNA系统在家蚕幼虫中高效分泌表达具有活性的抗紫杉醇scFv，为基于scFv的紫杉醇免疫分析提供了可行平台，同时也展示了该抗体作为紫杉醇和多西他赛毒性中和剂的潜在应用价值。
创新点
首次利用BmNPV bacmid DNA系统在家蚕幼虫血淋巴中高效分泌表达具有活性的抗紫杉醇scFv；该scFv的交叉反应性低于其亲本单抗，可提高紫杉醇检测的特异性；并展示其作为紫杉醇和多西他赛毒性中和剂的潜力。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | PT-scFv3A3 (VH-(GGGGS)5-VL) | 单链抗体PT-scFv3A3 | 调控 | 以包涵体形式表达，经体外复性后活性极低，未能用于进一步表征。 |
| 家蚕幼虫（Bombyx mori） | — | PT-scFv3A3 (VH-(GGGGS)5-VL) | 单链抗体PT-scFv3A3 | 调控 | 通过BmNPV bacmid DNA系统在血淋巴中分泌表达，为活性形式，可用于icELISA和交叉反应分析。 |
| Escherichia coli BmDH10Bac | — | 转座酶基因 | 转座酶 | 催化 | 由辅助载体表达，介导Tn7转座，将目的基因整合到BmNPV bacmid中。 |
| 家蚕幼虫（Bombyx mori） | — | 蜜蜂蜂毒明肽分泌信号（HMSS）基因 | 蜂毒明肽分泌信号肽 | 转运 | 引导表达的PT-scFv3A3分泌到家蚕幼虫血淋巴中。 |
关键发现
- 在大肠杆菌系统中，PT-scFv3A3以包涵体形式表达，从1 L培养物纯化得到18.2 mg变性蛋白，复性后从1 mg变性蛋白仅获得758.6 μg蛋白，且活性极低（iELISA几乎无结合）。在家蚕BmNPV bacmid系统中，每只B. mori幼虫可分泌表达并纯化约240 μg活性PT-scFv3A3（10只幼虫共2.41 mg），其反应性远高于大肠杆菌复性蛋白。icELISA显示PT-scFv3A3对紫杉醇的线性检测范围为0.156-5.00 μg/ml，对多西他赛为0.625-20.0 μg/ml。交叉反应性测试：对多西他赛31.1%、7-木糖基紫杉醇22.1%、头孢曼宁8.50%，对巴卡亭III、10-去乙酰巴卡亭III、1-羟基巴卡亭I、1-乙酰氧基-5-去乙酰巴卡亭I均<0.685%
- 其亲本PT-MAb3A3对应交叉反应性分别为70.7%、31.8%、6.17%及<0.111%。PT-scFv3A3的理论分子量约为30443 Da，等电点pI为8.95。
研究结论
BmNPV bacmid DNA系统是一种高效、经济且操作简单的真核表达平台，能够分泌表达具有天然构象和活性的scFv，适用于基于scFv的紫杉醇免疫分析，并可作为紫杉醇/多西他赛毒性的潜在解毒剂。