Rate-limiting steps in the Saccharomyces cerevisiae ergosterol pathway: towards improved ergosta-5,7-dien-3β-ol accumulation by metabolic engineering
- 作者
- Bin-Xiang Ma, Xia Ke, Xiao-Ling Tang, Ren-Chao Zheng, Yu-Guo Zheng
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2018）
- DOI
- 10.1007/s11274-018-2440-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过代谢工程改造酿酒酵母麦角固醇生物合成途径，提高维生素D4前体麦角-5,7-二烯-3β-醇的积累效率。
研究策略
靶向敲除erg5基因阻断麦角固醇终产物合成，分别过表达限速酶Hmg1p、Erg1p、Erg11p及转录因子等位基因upc2-1，考察工程菌株的生长、甾醇组成与产量及NADH/NAD+比例变化。
研究路线图
核心内容
该研究以酿酒酵母BY4741为底盘，通过代谢工程改造麦角固醇生物合成途径，以提高维生素D4前体麦角-5,7-二烯-3β-醇的积累。作者靶向敲除erg5基因阻断终产物合成，并分别过表达限速酶Hmg1p、Erg1p、Erg11p以及转录因子等位基因upc2-1，系统考察甾醇组成、产量及NADH/NAD+比例的变化。结果显示，erg5敲除菌株在YPD培养48小时后目标产物产量达4.12 mg/g DCW，占总游离甾醇的86.6%；过表达tHMG1虽使角鲨烯积累至1.87 mg/g，但目标产物反而降至对照的45.13%。过表达ERG1和ERG11可将目标产物产量分别提高12.38%和3.40%，而upc2-1在野生型中提高麦角固醇产量24.5%，在erg5敲除背景下却使目标产物降低24.0%。此外，erg5敲除菌株NADH/NAD+比值（0.708）显著高于野生型（0.431）。该研究明确了Hmg1p、Erg1p和Erg11p为该合成途径的限速酶，并首次揭示氧化还原失衡对产物积累的制约，为食品级酵母生产甾醇中间体提供了重要策略指导。
创新点
系统鉴定了麦角-5,7-二烯-3β-醇生物合成途径中的限速步骤（Hmg1p、Erg1p和Erg11p），并首次揭示erg5敲除导致的NADH/NAD+失衡对目标产物积累的负面影响。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯阶段） | erg5 | Erg5p | 催化 | C-22甾醇脱饱和酶，敲除后使麦角-5,7-二烯-3β-醇积累为优势甾醇 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | Hmg1p | 催化 | 截短的HMG-CoA还原酶，过表达导致角鲨烯积累，但目标产物产量下降 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯阶段） | ERG1 | Erg1p | 催化 | 角鲨烯环氧酶，过表达提高目标产物和总甾醇产量 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 麦角固醇生物合成途径（后鲨烯阶段） | ERG11 | Erg11p | 催化 | 甾醇14α-脱甲基酶，过表达提高目标产物和总甾醇产量 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 麦角固醇生物合成途径（全途径） | upc2-1 | Upc2p | 调控 | 转录因子等位基因（G888D突变），过表达上调甾醇生物合成基因，但在Δerg5中加剧氧化还原失衡 |
关键发现
- 敲除erg5后，酿酒酵母BY4741菌株在YPD培养基中培养48小时，麦角-5,7-二烯-3β-醇产量达到4.12±0.06 mg/g DCW，占总游离甾醇的86.6%
- 过表达tHMG1导致角鲨烯积累（Δerg5-tHMG1中1.87±0.35 mg/g），但目标产物产量降至1.79±0.10 mg/g，仅为对照的45.13%
- 过表达ERG1和ERG11分别使Δerg5菌株目标产物产量提高12.38%和3.40%，总甾醇产量分别提高16.8%和12.6%
- 在野生型中过表达upc2-1使麦角固醇产量提高24.5%（从9.23±0.39升至11.91±0.40 mg/g），但在Δerg5菌株中导致目标产物降低24.0%，总甾醇降低16.8%
- Δerg5菌株的NADH/NAD+比值为0.708±0.016，显著高于野生型的0.431±0.038，而Δerg5-upc2-1进一步升高至0.836±0.042。
研究结论
研究确定了Hmg1p、Erg1p和Erg11p是麦角-5,7-二烯-3β-醇合成途径的限速酶，并指出氧化还原平衡（NADH/NAD+比例）对产物积累至关重要，为食品级酿酒酵母生产甾醇相关中间体提供了重要指导。