Functional analysis of isoprenoid precursors biosynthesis by quantitative metabolomics and isotopologue profiling
- 作者
- Sara Castano-Cerezo, Hanna Kulyk-Barbier, Pierre Millard, Jean-Charles Portais, Stéphanie Heux, Gilles Truan, Florian Bellvert
- 单位
- LISBP, Université de Toulouse, CNRS, INRA, INSA, Toulouse, France; MetaToul-MetaboHUB, National Infrastructure of Metabolomics and Fluxomics, Toulouse, France
- 杂志
- Metabolomics（2019）
- DOI
- 10.1007/s11306-019-1580-8
- 所属领域
- 代谢工程/代谢组学
- 关键词
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解决的核心问题
现有方法无法同时准确量化和示踪所有类异戊二烯前体（甲羟戊酸途径及异戊烯基焦磷酸中间体）的浓度与同位素标记模式，阻碍了对类异戊二烯生物合成的功能研究和代谢通量分析。
研究策略
开发并验证一套完整的工作流：优化快速过滤采样和热提取步骤；建立基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的定量方法，采用稳定同位素稀释质谱（IDMS）和均匀13C标记酵母提取物作为内标；同时进行动态13C标记实验（ILE），使用IsoCor软件校正同位素分布并计算富集动力学。
研究路线图
核心内容
本研究建立了一套整合定量代谢组学与同位素示踪的工作流，用于分析酿酒酵母甲羟戊酸途径中全部八种类异戊二烯前体（MEV、M5P、M5PP、IPP/DMAPP、GPP、FPP、GGPP）。通过优化快速过滤采样和热提取条件，结合液相色谱-高分辨质谱与稳定同位素稀释质谱，以均匀13C标记酵母提取物为内标，实现了单次LC-MS运行中这些中间体的绝对定量，检测限低于0.1 pmol，线性范围0.1–50 pmol，变异系数小于20%。同时开展动态13C标记实验，首次获得所有异戊烯基焦磷酸中间体的同位素富集动力学数据。应用该工作流分析过表达HMG1t、ERG20、CrtE的S037菌株，发现GGPP浓度较野生型提高10倍，达12.8 nmol/gDCW；表达CrtB的S023菌株中GGPP池为8.5 nmol/gDCW，八氢番茄红素产量达1.2 μmol/gDCW。动态标记显示GGPP生物合成通量在S037和S023中分别提高9.0倍和7.0倍，且各菌株中间体标记动力学无显著差异，表明通量随池大小成比例增加。该工作流填补了类异戊二烯前体精确定量与示踪的技术空白，为菌株理性设计和代谢通量分析提供了可靠工具。
创新点
['首次实现单个LC-MS运行中同时定量甲羟戊酸途径和异戊烯基焦磷酸的8种前体（MEV、M5P、M5PP、IPP/DMAPP、GPP、FPP、GGPP）', '优化了采样和提取条件，显著提高回收率和可重复性', '使用全13C标记细胞提取物作为内标，实现高准确度绝对定量', '结合动态13C标记实验，首次获得所有异戊烯基焦磷酸中间体的同位素分布动力学数据', '将工作流应用于指导八氢番茄红素生产菌株的理性设计']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEN-PK2.1C | 甲羟戊酸途径 / 类异戊二烯生物合成 | HMG1t | HMG-CoA还原酶（截短型） | 催化 | 过表达以增强甲羟戊酸合成 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEN-PK2.1C | 甲羟戊酸途径 / 类异戊二烯生物合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶（FPP synthase） | 催化 | 过表达以促进FPP合成 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEN-PK2.1C | 甲羟戊酸途径 / 类异戊二烯生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPP synthase） | 催化 | 来源于Xanthophyllomyces dendrorhous，组成型表达 |
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CEN-PK2.1C | 甲羟戊酸途径 / 类异戊二烯生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶（phytoene synthase） | 催化 | 来源于Pantoea ananatis，将GGPP转化为八氢番茄红素 |
关键发现
该工作流对所有甲羟戊酸和异戊烯基焦磷酸中间体实现准确绝对定量（RSD<20%），检测限（LOD）低于0.1 pmol，线性范围0.1~50 pmol，定量限（LOQ）0.1~1.5 pmol，日内/日间重复性<20%。在S037菌株（过表达HMG1t、ERG20、CrtE）中，GGPP浓度较野生型提高10倍（从1.4±0.1增至12.8±2.0 nmol/gDCW，p=0.010），MEV、IPP/DMAPP、FPP也显著增加。在表达CrtB的S023菌株中，GGPP池为8.5±0.7 nmol/gDCW（p=0.056），八氢番茄红素产量达1.2±0.1 μmol/gDCW。动态13C标记实验中，各中间体T50范围为5分钟（M5P）至20分钟（GGPP），最终13C富集度约90%，三株菌的T50无显著差异（p>0.05），表明通量随池大小成比例增加，GGPP生物合成通量在S037和S023中分别较野生型提高9.0±2.6倍和7.0±1.6倍（p<0.01）。
研究结论
该工作流填补了类异戊二烯前体定量代谢组学和同位素示踪的关键技术空白，为类异戊二烯生物合成的功能研究、代谢通量分析以及菌株工程提供了可靠工具，并适用于其他原核和真核生物（调整采样和提取步骤后）。