Enzymatic reactions in teleocidin B biosynthesis
- 作者
- Takayoshi Awakawa
- 杂志
- Journal of Natural Medicines（2021）
- DOI
- 10.1007/s11418-021-01504-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
阐明teleocidin B生物合成中关键酶（TleB、TleC、TleD）的催化反应机制，尤其是萜烯环化、C-N键形成和逆转异戊二烯化等独特反应。
研究策略
结合基因簇鉴定、生化分析、X射线晶体结构解析、分子动力学模拟及定点突变等手段，从分子层面解析酶促反应机理。
研究路线图
核心内容
该研究系统解析了teleocidin B生物合成中关键酶TleB、TleC和TleD的催化机制。通过基因簇鉴定、生化分析、X射线晶体结构解析、分子动力学模拟及定点突变等手段，作者阐明了三个酶催化的独特反应。TleD催化SAM依赖的C-甲基化触发萜烯环化，氘标记实验证实氢原子从C-25迁移至C-26，产物包括teleocidin B-4、des-O-methylolivoretin C及微量teleocidin B-1。TleB与底物复合物晶体结构（1.90 Å分辨率）显示NMVT的N-1距血红素铁5.1 Å、N-13距铁4.3 Å，支持P450催化C-N键形成的双自由基机制。TleC结构中GPP的C-3与indolactam V的C-7距离3.3 Å，而C-1与N-1距离6.0 Å，明确了直接C-7逆转异戊二烯化的结构基础。TleD结构分辨率2.80 Å，SAH硫原子与C25距离4.5 Å。通过酶工程改造，TleC A173M突变体偏好DMAPP，W97Y/A173M双突变体产生非天然的C-19立体异构体teleocidin A-2。这些发现为通过酶工程和异源表达系统创制非天然PKC激活剂提供了理论基础。
创新点
首次鉴定由C-甲基化触发萜烯环化的酶学机制；提出P450催化C-N键形成的双自由基途径；阐明C10逆转异戊二烯化的结构基础；通过酶工程突变产生非天然立体异构体。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces blastmyceticus | teleocidin B生物合成 | tleA | TleA | 催化 | 非核糖体肽合成酶，合成N-甲基-L-缬氨酰-L-色氨醇(NMVT) |
| Streptomyces blastmyceticus | teleocidin B生物合成 | tleB | TleB | 催化 | P450单加氧酶，催化C-N键形成生成indolactam V |
| Streptomyces blastmyceticus | teleocidin B生物合成 | tleC | TleC | 催化 | 异戊烯基转移酶，催化indolactam V C-7位C10香叶基逆转异戊二烯化 |
| Streptomyces blastmyceticus | teleocidin B生物合成 | tleD | TleD | 催化 | SAM依赖C-甲基转移酶，催化C-25甲基化触发萜烯环化 |
| Streptococcalichus hindustanus | indolactam生物合成（同源） | hinD | HinD | 催化 | TleB同源蛋白，序列一致性57.5%，底物谱更广 |
| — | indolactam生物合成（同源） | mpnD | MpnD | 催化 | TleC同源蛋白，催化C5二甲基烯丙基转移到indolactam V同一位点 |
| Moorea producens | lyngbyatoxin A生物合成 | ltxB | LtxB | 催化 | P450单加氧酶，与TleB功能同源，催化C-N键形成 |
| Moorea producens | lyngbyatoxin A生物合成 | ltxC | LtxC | 催化 | 异戊烯基转移酶，与TleC功能同源 |
关键发现
- TleD催化SAM依赖的C-甲基化触发萜烯环化，氘标记实验显示D从C-25迁移至C-26，产物为teleocidin B-4、des-O-methylolivoretin C及微量teleocidin B-1
- TleB与NMVT复合物X射线结构分辨率1.90 Å，HinD与13复合物2.35 Å，NMVT的N-1距血红素铁5.1 Å，N-13距铁4.3 Å，支持双自由基机制
- TleC与MpnD结构分辨率分别为2.10 Å和1.40 Å，TleC中GPP的C-3与indolactam V的C-7距离3.3 Å，而C-1与N-1距离6.0 Å，支持直接C-7逆转异戊二烯化
- TleD结构分辨率2.80 Å，SAH硫原子与C25距离4.5 Å，teleocidin A-1二面角为58°
- TleC A173M突变体偏好DMAPP，W97Y/A173M突变体产生C-19立体异构体teleocidin A-2。
研究结论
基于X射线晶体结构阐明了teleocidin B生物合成中三个关键酶的反应机制，为通过酶工程和异源表达系统创制非天然PKC激活剂提供了理论基础。