Cloning of artemisinin biosynthetic cDNAs and novel ESTs and quantification of low temperature-induced gene overexpression
- 作者
- ZENG QingPing, ZHAO Chang, YIN LuLu, YANG RuiYi, ZENG XiaoMei, HUANG Ying, FENG LiLing, YANG XueQin
- 单位
- 广州中医药大学热带医学研究所生物技术实验室，广州510405，中国；广州军区广州总医院，广州510010，中国；广州中医药大学青蒿素研究中心，广州510405，中国
- 杂志
- Science in China Series C: Life Sciences（2008）
- DOI
- 10.1007/s11427-008-0032
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆青蒿中新的生物合成相关基因，并阐明低温诱导青蒿素生物合成基因过表达的调控机制。
研究策略
利用低温处理的开花期青蒿叶片提取RNA，通过RT-PCR、锚定RT-PCR和cDNA文库构建克隆全长cDNA和EST，测序并同源性分析；采用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测低温处理后青蒿素生物合成基因及新EST的表达变化，并用Ca2+通道抑制剂和螯合剂处理研究信号通路。
核心内容
该研究以低温处理的开花期青蒿叶片为材料，通过RT-PCR、锚定RT-PCR和cDNA文库构建克隆青蒿素生物合成相关基因，并利用半定量及实时荧光定量PCR检测低温下的表达变化，同时结合Ca2+通道抑制剂和螯合剂处理探究信号通路。共获得75条序列，其中71条EST为青蒿中未报道的新序列，37条为植物中首次克隆。低温处理使ADS和CYP71AV1的mRNA水平分别提高约10倍和7倍，而CPR表达不受显著影响；LaCl3和EGTA可抑制这一诱导效应，表明低温通过Ca2+-CaM信号转导途径过表达这两个关键基因，并伴随青蒿素产量增加。此外，低温处理48小时后CaM基因上调超过2.5倍，D/LTSRP、UCE、AR/DAP、POD1分别上调约8倍、5倍、2.3倍和1.5倍，而CHI和RGP无明显变化。该研究初步揭示了低温诱导青蒿素生物合成的协调调控机制，为代谢工程育种提供了重要基因资源和理论依据。
创新点
首次从低温处理的开花期青蒿叶片中克隆了75条序列，其中71条EST是青蒿中未曾报道的新序列，37条为植物中首次克隆的基因；首次发现低温可强烈诱导ADS和CYP71AV1基因表达而CPR不受影响；证明低温诱导的ADS和CYP71AV1过表达与Ca2+-CaM信号转导通路有关；定量了7个新EST的低温响应表达水平。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 青蒿（Artemisia annua） | 青蒿素生物合成 | ADS | amorpha-4,11-二烯合酶 | 催化 | 低温诱导表达，催化法尼基焦磷酸环化生成amorpha-4,11-二烯 |
| 青蒿（Artemisia annua） | 青蒿素生物合成 | CYP71AV1 | 细胞色素P450单加氧酶CYP71AV1 | 催化 | 低温诱导表达，催化amorpha-4,11-二烯氧化 |
| 青蒿（Artemisia annua） | 青蒿素生物合成 | CPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 低温下表达基本不变，为P450提供电子 |
| 青蒿（Artemisia annua） | 钙信号转导 | CaM | 钙调蛋白 | 调控 | 低温处理48h后表达上调2.5倍以上，参与Ca2+-CaM信号通路 |
| 青蒿（Artemisia annua） | 泛素-蛋白酶体通路 | UCE | 泛素结合酶 | 调控 | 低温诱导表达上调约5倍 |
| 青蒿（Artemisia annua） | 应激响应 | D/LTSRP | 干旱/低温和盐响应蛋白 | 调控 | 低温诱导表达上调约8倍 |
| 青蒿（Artemisia annua） | 应激响应 | AR/DAP | 生长素抑制/休眠相关蛋白 | 调控 | 低温诱导表达上调约2.3倍 |
| 青蒿（Artemisia annua） | 活性氧清除 | POD1 | 过氧化物酶1 | 催化 | 低温诱导表达上调约1.5倍 |
| 青蒿（Artemisia annua） | 防御反应 | CHI | 几丁质酶 | 催化 | 低温下表达无显著变化（0.85倍） |
| 青蒿（Artemisia annua） | RNA代谢调控 | RGP | 富含甘氨酸RNA结合蛋白 | 调控 | 低温下表达无显著变化（0.77倍） |
关键发现
- 从低温处理的青蒿叶片中共获得75条序列，其中4条全长cDNA与已知青蒿基因高度同源，71条EST为青蒿中未报道的新序列（34条与其他植物基因同源，37条在任何植物中无同源记录）。低温处理强烈诱导ADS和CYP71AV1基因表达，而CPR表达不受显著影响
- Ca2+通道抑制剂LaCl3和Ca2+螯合剂EGTA可抑制低温诱导的ADS和CYP71AV1过表达。实时荧光定量PCR显示，低温处理48h后CaM基因表达上调超过2.5倍，D/LTSRP、UCE、AR/DAP、POD1基因表达分别上调约8倍、5倍、2.3倍和1.5倍，CHI和RGP基因表达无显著变化（分别为0.85和0.77倍）。另有结果表明，低温使ADS和CYP71AV1的mRNA水平分别提高约10倍和7倍，并伴随青蒿素产量增加。
研究结论
本研究初步探索了3个青蒿素生物合成基因和7个新EST在低温诱导下的表达模式，表明低温通过Ca2+-CaM信号转导途径诱导ADS和CYP71AV1过表达，而CPR表达不受影响；同时定量了多个新EST的低温响应，为理解青蒿素生物合成的协调调控机制和代谢工程育种提供了重要依据。