TWO LEPIDOPTERAN CELL LINES STABLY TRANSFORMED BY THE ABC TRANSPORTER GENE PDR5 SHOW TOLERANCE TO DIACETOXYSCIRPENOL
- 作者
- D.-Y. Zhang, P. J. Krell, Q.-L. Feng
- 单位
- Great Lakes Forestry Centre, Canadian Forest Service; Department of Microbiology, University of Guelph
- 杂志
- In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal（2006）
- DOI
- 10.1007/s11626-006-0008-8
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
探究酵母ABC转运蛋白PDR5在鳞翅目昆虫细胞中异源表达后，是否能够赋予细胞对蛋白质合成抑制剂二乙酰氧基藜芦醇和蜕皮激素激动剂RH5992的耐受性，从而研究昆虫抗药机制。
研究策略
构建含有酵母pdr5基因的pIZ/pdr5表达载体，通过脂质体转染分别转化Sf21和CF-203两种鳞翅目昆虫细胞系，用Zeocin筛选稳定转化株；利用RT-PCR和Northern blot验证pdr5转录；通过细胞计数和形态观察比较转化细胞与对照细胞在不同浓度diacetoxyscirpenol下的存活率；利用14C标记的RH5992检测细胞内药物保留量。
核心内容
该研究将酵母多药耐药基因pdr5通过pIZ/pdr5载体稳定转入Sf21和CF-203两种鳞翅目昆虫细胞系，以探究异源ABC转运蛋白能否赋予细胞对霉菌毒素二乙酰氧基藜芦醇及蜕皮激素激动剂RH5992的耐受性。经Zeocin筛选后，RT-PCR和Northern blot确认了pdr5的稳定转录。在二乙酰氧基藜芦醇处理下，表达pdr5的Sf21细胞在6、8、10 ng/ml浓度下存活率分别为76.2%、52%和48.5%，显著高于对照细胞的22.6%、13%和8.8%；CF-203转化株在25至35 ng/ml浓度下存活率亦明显提升。然而，利用14C标记的RH5992进行保留实验发现，PDR5转化细胞与对照无显著差异，表明该转运蛋白无法有效外排RH5992。该结果首次证明酵母PDR5在鳞翅目细胞中可部分发挥外排功能，增强对特定毒素的耐受性，但其底物选择性发生改变，可能源于重组蛋白在昆虫细胞膜上的定位或折叠不完善。这一模型为在昆虫细胞中研究ABC转运蛋白功能提供了可行平台，同时提示异源表达系统可能影响转运蛋白的底物谱。
创新点
首次在鳞翅目昆虫细胞系（Sf21和CF-203）中稳定表达酵母多效药物抗性基因pdr5，并证明了该异源表达能够增强细胞对霉菌毒素二乙酰氧基藜芦醇的耐受性，为在昆虫细胞中研究ABC转运蛋白功能提供了模型。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sf21 (Spodoptera frugiperda卵巢细胞) | 多药耐药外排 | pdr5 | Pdr5p | 转运 | 来源于酿酒酵母的ABC转运蛋白，稳定整合到Sf21细胞中，增强对diacetoxyscirpenol的耐受性，但对RH5992无外排作用。 |
| CF-203 (Choristoneura fumiferana中肠细胞) | 多药耐药外排 | pdr5 | Pdr5p | 转运 | 来源于酿酒酵母的ABC转运蛋白，稳定整合到CF-203细胞中，增强对diacetoxyscirpenol的耐受性，但对RH5992无外排作用。 |
关键发现
- 成功建立了稳定表达pdr5的Sf21和CF-203细胞系，RT-PCR和Northern blot检测到pdr5转录本。在diacetoxyscirpenol处理下，pIZ/pdr5-Sf21细胞在6、8、10 ng/ml浓度下存活率分别为76.2%、52%和48.5%，而对照pIZ/V5-His-Sf21细胞仅分别为22.6%、13%和8.8%
- pIZ/pdr5-CF-203细胞在25、30、35 ng/ml浓度下存活率显著高于对照。然而，14C-RH5992保留实验显示，PDR5转化的细胞与对照相比无显著差异，表明PDR5不能有效外排RH5992。
研究结论
酵母PDR5在鳞翅目昆虫细胞中表达后能部分发挥外排功能，增强细胞对二乙酰氧基藜芦醇的耐受性，但不能外排蜕皮激素激动剂RH5992，可能由于重组蛋白在昆虫细胞膜中定位或折叠不完善导致底物选择性改变。