An Protocol for Genetic Transformation of Catharanthus roseus by Agrobacterium rhizogenes A4
- 作者
- Mei-Liang Zhou, Xue-Mei Zhu, Ji-Rong Shao, Yan-Min Wu, Yi-Xiong Tang
- 杂志
- Applied Biochemistry and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s12010-012-9568-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
建立长春花（Catharanthus roseus）发根培养的遗传转化体系，以研究萜类吲哚生物碱（TIAs）的代谢调控机制。
研究策略
利用发根农杆菌A4介导转化长春花叶片外植体，通过卡那霉素筛选、PCR及GUS染色验证转基因发根，并过表达转录因子CrOrca3，分析其对TIAs生物合成途径基因表达和长春质碱积累的影响。
核心内容
该研究利用发根农杆菌A4介导转化长春花叶片外植体，旨在建立高效的遗传转化体系，并探索转录因子CrOrca3过表达对萜类吲哚生物碱（TIAs）代谢调控的影响。研究中以卡那霉素筛选转基因发根，经PCR及GUS染色验证后，对获得的发根系进行目的基因表达分析和长春质碱含量测定。结果显示，无卡那霉素时发根诱导频率约85%，50 mg/L卡那霉素时降至约50%，而100 mg/L及以上浓度可完全抑制非转化根生长，据此确定100 mg/L为最佳筛选浓度。共获得9个空白转化系和7个CrOrca3过表达系，PCR确认所有发根均含rolA和rolB基因且无细菌污染。过表达发根中Orca3转录水平提升约4倍，Asα、Tdc、Dxs、Str、Cpr及Sgd等途径基因表达上调，但G10h未受影响。野生型根中未检出长春质碱，空白转化系平均含量约0.17 mg/g鲜重，而过表达系仅为约0.12 mg/g鲜重，表明Orca3过表达并未提升反而略微降低了长春质碱积累。该转化体系的成功建立为TIAs代谢工程研究提供了可行模型，而产量未增的结果提示G10h未被协同上调可能是限制碳流进入目标产物的关键节点。
创新点
确定了100 mg/L卡那霉素作为长春花发根转化的筛选浓度；系统分析了CrOrca3过表达对TIAs途径多个基因的转录影响及对长春质碱含量的效应；建立了高效、稳定的发根转化体系。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus (长春花) | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | CrOrca3 | ORCA3 | 调控 | AP2/ERF转录因子，过表达后上调Asα、Tdc、Dxs、Str、Cpr、Sgd转录，但G10h不变 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | Ri质粒T-DNA转化 | rolA | RolA | 调控 | TL-DNA上的发根诱导基因，与发根形成和持续生长相关 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | Ri质粒T-DNA转化 | rolB | RolB | 调控 | TL-DNA上的发根诱导基因，对发根形成至关重要 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | Ri质粒T-DNA转化 | ags | 农杆碱合成酶 (agropine synthase) | 催化 | TR-DNA上的标记基因，部分发根系中缺失 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | Asα | 邻氨基苯甲酸合酶α亚基 | 催化 | 编码色氨酸途径酶，受Orca3上调 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | Tdc | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 受Orca3上调 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | Dxs | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 | 催化 | 受Orca3上调 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | G10h | 牻牛儿醇10-羟化酶 | 催化 | 在Orca3过表达时表达水平不变 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | Cpr | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 受Orca3上调 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | Str | 异胡豆苷合酶 | 催化 | 受Orca3上调 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | 萜类吲哚生物碱生物合成途径 | Sgd | 异胡豆苷β-D-葡萄糖苷酶 | 催化 | 受Orca3上调 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发根 | 报告基因 | GUS | β-葡萄糖醛酸苷酶 | 催化 | 用于组织化学染色验证转化 |
关键发现
- 发根诱导频率在无卡那霉素培养基上约为85%，50 mg/L卡那霉素时约为50%，100和150 mg/L时完全抑制非转化根生长。获得9个A（空白转化）和7个O（CrOrca3过表达）发根系
- PCR证实所有发根含rolA和rolB基因，且无virC基因（无细菌污染）。Orca3过表达发根中Orca3转录水平提高4倍，Asα、Tdc、Dxs、Str、Cpr和Sgd转录水平升高，而G10h不变。野生型根中长春质碱未检出，A发根系平均含量约0.17 mg/g鲜重，O发根系约0.12 mg/g鲜重，表明Orca3过表达未提高反而略微降低了长春质碱积累。
研究结论
成功建立了农杆菌A4介导的长春花发根转化体系，该体系可作为研究TIAs代谢工程的模型。CrOrca3过表达虽上调部分途径基因，但未增加长春质碱产量，可能由于G10h未被上调所致。