Reconstruction of the Carotenoid Biosynthetic Pathway of Cronobacter sakazakii BAA894 in Escherichia coli
- 作者
- Wei Zhang, Xiaoqing Hu, Liqin Wang, Xiaoyuan Wang
- 单位
- State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, China; Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, China; Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Jiangnan University, Wuxi, China
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0086739
- 所属领域
- 合成生物学
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解决的核心问题
Cronobacter sakazakii的黄色素化学结构和生物合成途径未知，需要鉴定其生物合成基因簇并在异源宿主中重建。
研究策略
从C. sakazakii BAA894中提取纯化黄色素，通过UV、ESI/MS等鉴定结构；克隆其基因簇，在E. coli DH5α中逐步表达不同基因组合，分析各步产物，从而推导生物合成途径。
核心内容
本研究从阪崎克罗诺杆菌BAA894中提取并鉴定了其黄色素，经UV和ESI/MS分析确定主要为玉米黄素单糖苷和二糖苷。通过克隆其生物合成基因簇crtE-idi-crtXYIBZ，并在大肠杆菌DH5α中逐步表达不同基因组合，成功重建了类胡萝卜素生物合成途径。表达全部七个基因可产生玉米黄素二糖苷（0.74 mg/g）和单糖苷（0.41 mg/g），与原始菌株产物一致；表达部分基因组合则分别累积β-胡萝卜素（0.91 mg/g）、番茄红素（0.83 mg/g）等中间产物。研究发现引入idi基因可使类胡萝卜素总产量从0.6 mg/g提高60%至0.96 mg/g，表明该基因对通量提升具有重要作用。该工作首次阐明了阪崎克罗诺杆菌黄色素的化学结构及其合成基因簇功能，证明该基因簇可在异源宿主中指导合成从番茄红素到玉米黄素糖苷的系列类胡萝卜素，为微生物生产高价值类胡萝卜素提供了新的基因资源和代谢改造策略。
创新点
首次鉴定了C. sakazakii BAA894黄色素为玉米黄素单糖苷和二糖苷；确定了负责其合成的七个基因簇crtE-idi-crtXYIBZ，并在E. coli中成功重建，实现了多种类胡萝卜素的异源合成。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自C. sakazakii BAA894，催化FPP延伸为GGPP |
| E. coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成途径 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 来自C. sakazakii BAA894，催化IPP转化为DMAPP |
| E. coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自C. sakazakii BAA894，催化GGPP转化为八氢番茄红素 |
| E. coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自C. sakazakii BAA894，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| E. coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 来自C. sakazakii BAA894，催化番茄红素环化为β-胡萝卜素 |
| E. coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自C. sakazakii BAA894，催化β-胡萝卜素羟化为玉米黄素或隐黄质 |
| E. coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtX | 玉米黄素葡萄糖基转移酶 | 催化 | 来自C. sakazakii BAA894，催化玉米黄素糖基化生成单糖苷和二糖苷 |
关键发现
- C. sakazakii BAA894的黄色素主要为玉米黄素-二糖苷（CS1）和玉米黄素-单糖苷（CS2），产量分别为65 μg/g和34 μg/g干重
- 在E. coli DH5α中表达全部七个基因（crtE-idi-crtXYIBZ）可产生相同的玉米黄素-二糖苷（EC1，0.74 mg/g）和单糖苷（EC2，0.41 mg/g）
- 含idi的菌株DH5α/pWSK29-EiIB的类胡萝卜素产量（0.96 mg/g）比不含idi的菌株（0.6 mg/g）提高60%
- 表达六个基因（crtE-idi-crtZIB）可产生玉米黄素（EC3，0.57 mg/g）和隐黄质（EC4，0.39 mg/g）
- 表达五个基因（crtE-idi-crtYIB）产生β-胡萝卜素（EC5，0.91 mg/g），表达四个基因（crtE-idi-crtIB）产生番茄红素（EC6，0.83 mg/g）
- 经离子色谱分析，糖基部分的己糖为葡萄糖。
研究结论
本研究鉴定了C. sakazakii BAA894中负责黄色素合成的基因簇crtE-idi-crtXYIBZ，并通过在E. coli中异源表达重建了类胡萝卜素生物合成途径，证明该基因簇可指导合成从番茄红素到玉米黄素糖苷的一系列类胡萝卜素，为微生物生产类胡萝卜素提供了新的基因资源。