Adaptive Evolution of Saccharomyces cerevisiae with Enhanced Ethanol Tolerance for Chinese Rice Wine Fermentation

作者: Shuang Chen, Yan Xu
杂志: Applied Biochemistry and Biotechnology（2014）
DOI: 10.1007/s12010-014-0978-z
所属领域: 发酵工程
关键词: Adaptive evolutionChinese rice wineEthanol toleranceSaccharomyces cerevisiae
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解决的核心问题

中国黄酒工业酵母G85在发酵后期因高浓度乙醇积累导致细胞死亡和发酵迟缓，需要提高其乙醇耐受性以改善发酵性能。

研究策略

采用EMS化学诱变增加遗传多样性，然后以黄酒类发酵环境中自身产生的高浓度乙醇作为选择压力，通过连续批次传代进行适应性进化，经过约200代后筛选出乙醇耐受突变株G85X-8。

研究路线图

100%

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核心内容

针对中国黄酒工业酵母G85在发酵后期因乙醇积累导致细胞死亡和发酵迟滞的问题，该研究采用EMS化学诱变结合连续批次传代的适应性进化策略，以发酵过程中自然产生的乙醇作为选择压力，经过约200代筛选获得非转基因突变株G85X-8。在18%（v/v）乙醇处理7天后，亲本G85死亡率超过90%，而进化混合群体低于50%；批次发酵中G85X-8残糖降至7.03 g/L，酵母死亡率42.57%，显著优于亲本的10.35 g/L和93.54%。实验室黄酒发酵中G85X-8残糖4.13 g/L、乙醇产量20.15%，14天死亡率低于20%。生理机制分析显示，G85X-8细胞膜油酸和亚油酸比例升高，C18/C16比值由34.68%升至40.30%，不饱和度指数提升，同时胞内海藻糖含量较亲本提高85.62%。香气分析虽显示部分高级醇和有机酸有差异，但感官评价无显著差异。结果表明，利用发酵过程中自身产生的乙醇作为选择压力进行适应性进化是获得非转基因乙醇耐受酵母的有效策略，所得菌株可改善黄酒发酵性能且不改变主要风味特征，具备工业应用潜力。

创新点

首次在类工业发酵环境中利用发酵过程中自然产生的乙醇作为选择压力进行适应性进化；获得的非转基因突变株G85X-8不仅乙醇耐受性显著提高，还表现出增强的渗透压和温度耐受性；揭示了细胞膜脂肪酸组成改变和胞内海藻糖积累可能是耐受性提高的生理基础。

研究对象（4）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Saccharomyces cerevisiae G85	乙醇发酵	—	—	催化	中国黄酒工业酵母菌株，经EMS诱变和适应性进化获得乙醇耐受突变株G85X-8
Saccharomyces cerevisiae G85X-8	脂质代谢	—	—	区室化	细胞膜脂肪酸组成改变：油酸和亚油酸比例升高，肉豆蔻酸降低，C18/C16比值升高，不饱和度指数提高，增强膜在乙醇应激下的稳定性
Saccharomyces cerevisiae G85X-8	海藻糖代谢	—	—	调控	胞内海藻糖积累较亲本提高85.62%，作为应激保护物质增强乙醇耐受性
Saccharomyces cerevisiae G85X-8	应激响应	—	—	调控	除乙醇耐受外，还表现出增强的渗透压（如1.0 mol/L NaCl、2.0 mol/L sorbose）和温度（55℃热激10 min）耐受性

关键发现

经过约200代适应性进化，突变株G85X-8的乙醇耐受性显著提高
在18%（v/v）乙醇处理7天后，亲本G85死亡率>90%，而进化200代混合群体死亡率<50%。在批次发酵中，G85X-8残糖为7.03 g/L（亲本10.35 g/L），酵母死亡率42.57%（亲本93.54%）。实验室黄酒发酵中，G85X-8残糖4.13 g/L（亲本6.71 g/L），乙醇产量20.15%（v/v，亲本19.77%），14天后酵母死亡率<20%（亲本>80%）。G85X-8细胞膜中油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）比例显著升高，肉豆蔻酸（C14:0）降低，C18/C16比值由34.68%升至40.30%，不饱和度指数由57.51%升至60.29%。G85X-8胞内海藻糖含量比亲本高85.62%，G85X-5高68.53%。香气分析显示部分高级醇和有机酸有显著差异（如乙酯类等），但感官评价无显著差异。

研究结论

适应性进化是利用发酵过程自身产生的乙醇作为选择压力获得非转基因乙醇耐受酵母的有效策略，得到的G85X-8菌株可改善中国黄酒发酵性能，且不改变主要香气特征，适合工业应用。