Cloning and Characterization of an Enantioselective l-Menthol Benzoate Hydrolase from Acinetobacter sp. ECU2040
- 作者
- Jin-Gang Yin, Guo-Chao Xu, Gao-Wei Zheng, Jian-He Xu
- 杂志
- Applied Biochemistry and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s12010-015-1632-0
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏能够高效对映选择性水解 dl-薄荷醇苯甲酸酯生成 l-薄荷醇的新型酯酶，需要从自然界发掘并表征新的酶催化剂。
研究策略
通过鸟枪法构建 Acinetobacter sp. ECU2040 的基因组文库，以甘油三丁酸酯指示剂筛选酯酶阳性克隆，再经 dl-薄荷醇苯甲酸酯活性验证得到目标基因 abmbh，并在 E. coli BL21(DE3) 中异源表达、纯化后系统表征酶学性质。
核心内容
研究人员通过鸟枪法构建了Acinetobacter sp. ECU2040的基因组文库，以甘油三丁酸酯指示剂筛选酯酶阳性克隆，进而克隆到新型酯酶基因abmbh，并在E. coli BL21(DE3)中实现了异源表达和纯化。该基因全长1080 bp，编码360个氨基酸，理论分子量约40.7 kDa。重组酶AbMBH以pNPB为底物时最适温度为50°C、最适pH为8.5；水解dl-薄荷醇苯甲酸酯时，KM为2.6 mM，kcat为0.26 s⁻¹，对映体选择性E=27.5，12小时转化率达43.7%，产物对映体过量值ee_p为86.3%。该酶对多种dl-薄荷醇酯均有活性，其中对dl-薄荷醇乙酸酯的选择性最高（E=44.2）。酶在30°C下半衰期为16.2小时，Ag⁺和PMSF可完全或强烈抑制其活性。该酶与已知同类酯酶序列同源性低于12%，是一全新的l-薄荷醇苯甲酸酯水解酶，可作为蛋白质工程改造的理想起点，为工业化生产l-薄荷醇提供了具有应用潜力的新催化剂。
创新点
首次从 Acinetobacter sp. ECU2040 中克隆并表征了一个新的 l-薄荷醇苯甲酸酯水解酶 AbMBH，其与已知同类酶（如 LIP1、BsubE、BsteE、BSE）的序列同源性低于12%，为通过定向进化或理性设计提升催化性能提供了全新起点。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Acinetobacter sp. ECU2040 | — | abmbh | AbMBH | 催化 | 来源菌株，其基因组文库用于筛选对映选择性水解 dl-薄荷醇苯甲酸酯的酯酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | abmbh | AbMBH | 催化 | 重组表达宿主，通过 pET-28a(+) 载体表达 His 标签融合蛋白 |
关键发现
- 克隆到的 abmbh 基因长 1080 bp，编码 360 个氨基酸，理论分子量
- 7 kDa。重组酯酶 AbMBH 以 pNPB 为底物时最适温度 50°C，最适 pH
- 5；以 dl-薄荷醇苯甲酸酯为底物时，KM 为
- 6 mM，kcat 为
- 26 s^-1，kcat/KM 为
- 1 mM^-1 s^-1，对映体选择性 E=27.5。对不同 dl-薄荷醇酯的活性/选择性差异显著，其中对 dl-薄荷醇乙酸酯的 E 最高（44.2），对 dl-薄荷醇丁酸酯 E=10.9，对 dl-薄荷醇氯乙酸酯 E=4.2。水解 dl-薄荷醇苯甲酸酯时，12 h 转化率为
- 7%，产物 ee_p 达
- 3%，比活力为
- 34 U/mg。在 30°C 下酶的半衰期为
- 2 h；Ag+ 和 PMSF 完全或强烈抑制酶活性，EDTA 抑制
- 7%。
研究结论
成功从 Acinetobacter sp. ECU2040 中获得并异源表达了一种新型 l-薄荷醇苯甲酸酯水解酶 AbMBH。该酶能对映选择性水解多种 dl-薄荷醇酯，对 dl-薄荷醇苯甲酸酯具有中等对映选择性（E=27.5），且与已知活性酶序列同源性低，是进行蛋白质工程改造以提升催化活性、对映选择性和稳定性的理想起始生物催化剂，具有潜在的工业应用价值。