Cloning, Expression, and Characterization of budC Gene Encoding meso-2,3-Butanediol Dehydrogenase from Bacillus licheniformis
- 作者
- Guo-Chao Xu, Ya-Qian Bian, Rui-Zhi Han, Jin-Jun Dong, Ye Ni
- 杂志
- Applied Biochemistry and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s12010-015-1897-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表征地衣芽孢杆菌的meso-2,3-丁二醇脱氢酶（B/BDH），解析其酶学性质，为定向改造地衣芽孢杆菌生产手性2,3-丁二醇提供理论依据。
研究策略
从B. licheniformis基因组扩增budC基因，构建pET28a-budC重组质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，经Ni亲和纯化，系统表征其pH、温度、金属离子依赖性、底物特异性、动力学参数和立体选择性。
核心内容
该研究从地衣芽孢杆菌基因组中克隆了budC基因，编码meso-2,3-丁二醇脱氢酶（B/BDH），并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，经Ni亲和纯化获得重组酶。酶学表征显示，B/BDH属于SDR超家族SDR69C亚家族，为NADH依赖的均四聚体，亚基分子量31.3 kDa。该酶具有双功能催化活性：在NADH存在下，可将双乙酰不对称还原为(3S)-乙偶姻（97.3% ee），进一步还原为(2S,3S)-2,3-丁二醇（97.3% ee，96.5% de）。双乙酰还原最适pH为5.0，2,3-丁二醇氧化最适pH为10.0，最适温度37°C，50°C下半衰期约40分钟。对乙偶姻还原的Km为0.47 mM，催化效率kcat/Km达432 s⁻¹·mM⁻¹；对2,3-丁二醇氧化效率约81.5 s⁻¹·mM⁻¹。底物偏好邻二酮和邻二醇。该工作首次系统表征了地衣芽孢杆菌来源BDH的酶学性质，其高效还原乙偶姻的活性提示该酶在体内偏向于催化2,3-丁二醇生成方向，为利用蛋白质工程优化其对映选择性、实现手性2,3-丁二醇的微生物合成提供了关键酶学工具。
创新点
首次详细表征了B. licheniformis来源的meso-2,3-BDH的酶学性质，发现其具有双功能催化活性（还原和氧化），且对乙偶姻还原具有较高的催化效率（kcat/Km=432 s^-1·mM^-1），为手性2,3-丁二醇的生物合成提供了新酶学工具。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus licheniformis | 2,3-丁二醇生物合成通路 | budC | meso-2,3-丁二醇脱氢酶 (B/BDH) | 催化 | 原始宿主中的meso-2,3-BDH编码基因，负责双乙酰还原为乙偶姻及2,3-丁二醇 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | budC | meso-2,3-丁二醇脱氢酶 (B/BDH) | 催化 | 重组表达宿主，用于B/BDH的异源表达和纯化 |
关键发现
- B/BDH在NADH存在下催化双乙酰还原为(3S)-乙偶姻（97.3% ee），进一步还原为(2S,3S)-2,3-丁二醇（97.3% ee, 96.5% de）。对双乙酰还原和2,3-丁二醇氧化的最适pH分别为5.0和10.0
- 对乙偶姻还原的Km=0.47 mM，kcat/Km=432 s^-1·mM^-1
- 对2,3-丁二醇的Km=7.25 mM，kcat/Km≈81.5 s^-1·mM^-1。纯酶比活力120 U/mg（双乙酰为底物），最适温度37°C，50°C下半衰期约40 min。B/BDH属于SDR超家族SDR69C亚家族，为NADH依赖的均四聚体（亚基31.3 kDa）。底物特异性表明其偏好邻二酮和邻二醇。
研究结论
成功克隆并表达了编码B/BDH的budC基因，该酶属于典型的SDR超家族，具有NADH依赖的氧化还原酶活性，能不对称还原双乙酰为(2S,3S)-2,3-丁二醇，立体选择性约97.3% ee。其酶学特性表明B/BDH在B. licheniformis中偏向于乙偶姻还原为2,3-丁二醇，为今后通过蛋白质工程提高其对映体选择性、实现手性2,3-丁二醇的微生物生产奠定了基础。