Diversity of Lactobacillus reuteri Strains in Converting Glycerol into 3-Hydroxypropionic Acid
- 作者
- G. Burgé, C. Saulou-Bérion, M. Moussa, B. Pollet, A. Flourat, F. Allais, V. Athès, H.E. Spinnler
- 杂志
- Applied Biochemistry and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s12010-015-1787-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
比较三株罗伊氏乳杆菌（DSM 20016、DSM 17938、ATCC 53608）将甘油转化为3-羟基丙酸（3-HP）的性能差异，并探究生物转化过程中的产物抑制现象。
研究策略
在相同批次条件下对比三株菌的甘油消耗、产物（3-HP、3-HPA、1,3-PDO）积累动力学，计算产率与摩尔平衡；利用13C NMR鉴定产物；通过流式细胞术和活菌计数评估细胞生理状态；单独添加各代谢物研究其对DSM 17938的毒性；结合基因组序列比对分析酶序列差异。
核心内容
本研究系统比较了三株罗伊氏乳杆菌（DSM 20016、DSM 17938、ATCC 53608）在批次培养中将甘油转化为3-羟基丙酸（3-HP）的性能差异。在相同条件下，ATCC 53608获得最高3-HP积累（3.1 g/L，2 h），DSM 20016和DSM 17938分别为2.4 g/L和2.3 g/L，但DSM 17938积累的中间产物3-HPA最多（5.0 g/L），且三株菌的3-HP/1,3-PDO摩尔比均大于1（1.25～1.65），表明NADH氧化酶活性影响了还原产物分配。通过13C NMR确认产物结构，流式细胞术与活菌计数显示甘油转化导致菌落形成能力在2～3 h内完全丧失，DSM 17938的酶活性细胞在3 h下降约40%，24 h后仅剩1.2%。产物毒性实验表明3-HPA对细胞生理状态影响最大，3-HP仅在低pH（pH 3）时表现毒性，1,3-PDO无毒性。在pH 6的生物反应器中，DSM 17938的3-HPA产量达5.6 g/L（产率0.86 mol/mol），但3-HP产率仅0.11 mol/mol，摩尔平衡为73%～88%。这些结果表明未修饰菌株可实现约2 g/L/h的3-HP和4 g/L/h的3-HPA生产率，产物抑制尤其是3-HPA和低pH是限制转化效率的关键因素，DSM 17938最具进一步优化潜力。
创新点
首次系统比较三株L. reuteri的甘油转化性能与质量平衡；将细胞生理状态（酶活性和膜完整性）与产物毒性关联；揭示3-HP/1,3-PDO比值大于1的现象并归因于NADH氧化酶活性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Lactobacillus reuteri DSM 20016 | 甘油转化为3-羟基丙酸途径（pdu操纵子） | — | 甘油脱水酶（GDH） | 催化 | 催化甘油转化为3-HPA，辅酶B12依赖 |
| Lactobacillus reuteri DSM 20016 | 甘油转化为3-羟基丙酸途径（pdu操纵子） | — | 丙醛脱氢酶（PduP） | 催化 | 将3-HPA氧化为3-HP-CoA，消耗NAD+；文献报道可能兼作甘油载体 |
| Lactobacillus reuteri DSM 20016 | 甘油转化为3-羟基丙酸途径（pdu操纵子） | — | 磷酸转乙酰酶（PduL） | 催化 | 将3-HP-CoA转化为3-HP磷酸并释放CoA |
| Lactobacillus reuteri DSM 20016 | 甘油转化为3-羟基丙酸途径（pdu操纵子） | — | 丙酸激酶（PduW） | 催化 | 生成3-HP和ATP |
| Lactobacillus reuteri DSM 20016 | 甘油转化为3-羟基丙酸途径（pdu操纵子） | — | 1,3-丙二醇氧化还原酶（PduQ） | 催化 | 将3-HPA还原为1,3-PDO，消耗NADH |
| Lactobacillus reuteri DSM 17938 | 辅因子再生 | — | NADH氧化酶（EC 1.6.99.3） | 能量供给 | 氧化NADH再生NAD+，可解释3-HP/1,3-PDO比值大于1 |
| Lactobacillus reuteri DSM 20016 | 甘油转运 | — | PduP蛋白 | 转运 | 文献报道为甘油载体（Morita等），但本研究序列比对未发现菌株间差异 |
关键发现
- ATCC 53608菌株3-HP积累最高（3.1 g/L，2 h），DSM 20016次之（2.4 g/L，1 h），DSM 17938为2.3 g/L（1.5 h）；最大3-HPA浓度分别为DSM 17938
- 0 g/L、ATCC 53608
- 4 g/L、DSM 20016
- 1 g/L；3-HP/1,3-PDO摩尔比分别为1.65（DSM 17938）、1.59（DSM 20016）、1.25（ATCC 53608）；三株菌的摩尔平衡为73%～88%；DSM 17938在生物反应器（pH 6）中3-HPA产量达5.6 g/L，产率0.86 mol/mol，但3-HP产率仅0.11 mol/mol；甘油转化导致菌落形成能力在2～3 h内完全丧失，DSM 17938酶活性细胞在3 h下降约40%，24 h后仅剩1.2%；3-HPA对细胞生理状态影响最大，3-HP仅在pH 3时表现毒性，pH 5时无显著影响；1,3-PDO无毒性。
研究结论
未修饰的L. reuteri在非优化条件下可实现约2 g/L/h的3-HP和4 g/L/h的3-HPA生产率，其中DSM 17938最具应用潜力；产物抑制（尤其是3-HPA和低pH）是限制生物转化效率的关键因素，后续可通过调控pH、原位产物分离或分批补料策略优化。