Characterization of a Ginsenoside-Transforming β-glucosidase from Paenibacillus mucilaginosus and Its Application for Enhanced Production of Minor Ginsenoside F2
- 作者
- Chang-Hao Cui, Jin-Kwang Kim, Sun-Chang Kim, Wan-Taek Im
- 单位
- Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Yuseong-gu, Daejeon, Republic of Korea; KAIST Institute for Biocntury, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Yuseong-gu, Daejeon Republic of Korea; Intelligent Synthetic Biology Center, Yuseong-gu, Daejeon, Republic of Korea
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0085727
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
稀有人参皂苷F2在天然人参中含量极低（<0.01%），难以获得，需要开发高效、可规模化的生物转化方法以满足医药和功能食品行业需求。
研究策略
从Paenibacillus mucilaginosus中克隆并异源表达β-葡萄糖苷酶BglPm，表征其酶学性质；将其与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf22-3联用，以原人参二醇型皂苷混合物（PPDGM）为底物进行两步生物转化，并通过HP20柱层析纯化，实现F2的百克级生产。
核心内容
本研究从Paenibacillus mucilaginosus中克隆并异源表达了GH1家族β-葡萄糖苷酶BglPm，用于稀有人参皂苷F2的规模化生物转化。BglPm基因长1260 bp，编码419个氨基酸，分子量47.72 kDa，最适反应条件为45°C和pH 7.5，对人参皂苷Rb1和Rd的Km分别为0.384和0.352 mM，显示出良好的底物亲和力，其转化路径为Rb1→Gyp XVII→F2和Rd→F2。将该酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf22-3联用，以原人参二醇型皂苷混合物为底物，在50 mg/ml底物浓度下7小时内可完全转化。在百克级放大生产中，250 g底物经两步酶转化和HP20柱层析纯化，获得152 g F2，色谱纯度达80.1%，回收率95.7%（以Rb1、Rc、Rd总摩尔量162.2 mmol计算，产F2 155.2 mmol）。这一结果证明BglPm与Abf22-3的组合策略能够高效地将丰富的主要人参皂苷转化为稀有皂苷F2，产品纯度与回收率均满足工业应用要求，为F2的药理研究和功能食品开发提供了可行的生产路线。
创新点
1）鉴定并表征了一种新的GH1家族人参皂苷转化β-葡萄糖苷酶BglPm，可特异性地将Rb1和Rd转化为F2；2）首次实现了利用重组酶在100克规模上生产F2，从250 g PPDGM获得152 g F2（纯度80.1%，回收率95.7%）。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | — | — | — | 异源表达宿主 |
| — | 人参皂苷（protopanaxadiol型）生物转化 | bglPm | BglPm | 催化 | GH1家族β-葡萄糖苷酶，水解C3/C20位外侧葡萄糖，将Rb1转化为Gyp XVII和F2，将Rd转化为F2 |
| — | 人参皂苷（protopanaxadiol型）生物转化 | abf22-3 | Abf22-3 | 催化 | 来自Leuconostoc sp. 22-3的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，水解Rc为Rd |
关键发现
- bglPm基因长1260 bp，编码419 aa，蛋白分子量47.72 kDa，pI
- 27；最适温度45°C，最适pH
- 5，在pH
- 0时活性残留17.4%，30°C和37°C下相对活性分别为63.7%和73.5%；动力学参数：对pNPGlc的Km为3.24 mM，kcat/Km为2.56 mM-1s-1，对Rb1的Km为0.384 mM，对Rd的Km为0.352 mM，kcat/Km分别为1.23和1.78；转化路径为Rb1→Gyp XVII→F2和Rd→F2；在50 mg/ml底物浓度下7 h内完全转化；规模化生产中，250 g PPDGM经Abf22-3和BglPm联用，得到152 g F2，色谱纯度80.1%，回收率95.7%（以Rb1、Rc、Rd总摩尔量162.2 mmol计算，产F2
- 2 mmol）。
研究结论
BglPm是一种高效转化主要人参皂苷Rb1和Rd为稀有皂苷F2的β-葡萄糖苷酶，与Abf22-3联合使用可从丰富PPDGM中规模化生产F2，所得产品纯度80.1%，回收率95.7%，满足工业需求，为F2的药理研究和应用提供了可行路线。