Cloning, Expression, Mutagenesis Library Construction of Glycerol Dehydratase, and Binding Mode Simulation of Its Reactivase with Ligands
- 作者
- Wei Jiang, Wenjun Li, Yan Hong, Shizhen Wang, Baishan Fang
- 杂志
- Applied Biochemistry and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s12010-015-1906-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
提高甘油脱水酶(GDHt)的活性和表达量，并探究其再激活因子(GDHtR)与配体的结合模式，以降低酶法生产1,3-丙二醇和3-羟基丙醛的成本。
研究策略
克隆肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的gldABC基因，构建pET-32a-gldABC(胞内表达)和pET-22b-gldABC(胞外表达)载体，在大肠杆菌中表达并测定酶活；构建含gldB的突变文库(去掉gldB的pET-32a-gldAC载体，易错PCR引入突变)；用DOCK6.0进行半柔性分子对接模拟GDHtR与ATP、CTP、GTP的结合模式。
核心内容
本研究从肺炎克雷伯氏菌中克隆了甘油脱水酶编码基因gldABC（全长2735 bp），分别构建pET-32a-gldABC胞内表达和pET-22b-gldABC胞外表达载体，在大肠杆菌中实现重组表达。结果显示，胞外表达酶活达6.8 U/mg，胞内表达为3.2 U/mg，分别约为野生型的6倍和3倍。以甘油为底物时，1 min内G/P比值达2.45，10 min后降至0.53，证实甘油诱导的快速失活现象。通过去除gldB基因并利用易错PCR构建了β亚基突变文库，为后续定向进化奠定基础。分子对接模拟表明，GDHtR与ATP、CTP、GTP的结合模式高度相似，分别形成9、9和8个氢键，结合自由能（grid score）为-74.082、-75.311和-82.145 kcal/mol，其中范德华力贡献占主导。该结果提示CTP和GTP可能替代ATP作为再激活因子，为寻找廉价ATP替代物、降低1,3-丙二醇和3-羟基丙醛酶法生产成本提供了重要依据。
创新点
1. 实现了GDHt在大肠杆菌中的胞外表达，酶活达6.8 U/mg，较野生型提高约6倍；2. 揭示了β亚基氨基酸改变通过调节Co-N键长度影响Co-C键均裂速率从而改变酶活；3. 首次通过半柔性分子对接模拟了GDHtR与ATP、CTP、GTP的结合模式，发现三者结合模式几乎无差异。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella pneumoniae DSM2026 | 甘油→3-羟基丙醛→1,3-丙二醇 | gldABC | 甘油脱水酶(GDHt) | 催化 | 基因来源菌株 |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 甘油→3-羟基丙醛→1,3-丙二醇 | gldABC | 重组甘油脱水酶(GDHt) | 催化 | 胞内/胞外表达宿主 |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 甘油→3-羟基丙醛→1,3-丙二醇 | gldB | GDHt β亚基 | 调控 | β亚基突变可调节Co-N键长度，影响Co-C键均裂速率 |
| Klebsiella pneumoniae | 甘油脱水酶再激活 | — | 甘油脱水酶再激活因子(GDHtR) | 调控 | 分子伴侣，ATP依赖性再激活 |
| — | 甘油脱水酶再激活 | — | ATP/CTP/GTP配体 | 能量供给 | 分子对接配体，模拟与GDHtR结合，CTP和GTP可部分替代ATP |
关键发现
- 克隆的gldABC基因全长2735 bp，α/β/γ亚基分别编码1668/585/426 bp。胞外表达酶活为6.8 U/mg，胞内为3.2 U/mg，分别约为野生型的6倍和3倍。以甘油为底物时，1 min内G/P比值2.45，10 min后降至0.53，表明甘油导致酶快速失活。GDHt的Co-N键长为2.6 Å，DDH为2.5 Å，CN-cbl为2.18 Å。分子对接显示，GDHtR与ATP形成9个氢键，与CTP形成9个，与GTP形成8个
- 结合自由能(grid score)分别为-74.082、-75.311、-82.145 kcal/mol，其中范德华力贡献占主导。
研究结论
本研究成功克隆并表达了甘油脱水酶，构建了β亚基突变库，并通过分子对接发现GDHtR与ATP、CTP、GTP的结合模式高度相似，表明CTP和GTP可能替代ATP，为建立定量构效关系和寻找廉价ATP替代物提供了基础，有利于1,3-PD和3-HPA的酶法高效生产。