Production of Rebaudioside A from Stevioside Catalyzed by the Engineered Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Yan Li, Yangyang Li, Yu Wang, Liangliang Chen, Ming Yan, Kequan Chen, Lin Xu, Pingkai Ouyang
- 杂志
- Applied Biochemistry and Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s12010-015-1969-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用工程化酿酒酵母全细胞催化将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，解决体外酶法需要昂贵UDP-葡萄糖的问题。
研究策略
构建含PGK1-TEF1双向组成型启动子的新型表达载体pTP，在酿酒酵母YPH499中组成型表达甜叶菊UDP-糖基转移酶UGT76G1；以葡萄糖为碳源体内再生成UDP-葡萄糖，通过添加柠檬酸抑制磷酸果糖激酶以调控代谢流，优化细胞透性、温度、pH、Mg2+浓度及葡萄糖补料等全细胞催化条件。
核心内容
本研究构建了含PGK1-TEF1双向组成型启动子的新型表达载体pTP，在酿酒酵母YPH499中组成型表达甜叶菊UDP-糖基转移酶UGT76G1，以葡萄糖为碳源体内再生UDP-葡萄糖，实现无需外源UDP-葡萄糖的全细胞催化将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A。通过添加柠檬酸抑制磷酸果糖激酶将碳流导向UDP-葡萄糖合成，并优化了细胞透性、温度、pH、Mg²⁺浓度及葡萄糖补料等催化条件。结果显示，在含2 g/L甜菊苷的反应体系中，经1%甲苯渗透处理、30°C和pH 8.0条件下，48 h内莱鲍迪苷A产量达1160.5 mg/L，转化率48%；1%甲苯渗透处理使产量提高77.6倍，补料20或40 g/L葡萄糖使产量分别提高1.8和2.7倍。该策略通过代谢调控与组成型表达相结合，实现了甜菊苷向高附加值莱鲍迪苷A的高效生物转化，为无需昂贵辅底物的全细胞催化生产提供了可行途径。
创新点
构建了新型组成型双向启动子表达载体pTP；利用柠檬酸作为代谢调控剂，通过抑制磷酸果糖激酶将碳流导向UDP-葡萄糖合成；实现了无需外源UDP-葡萄糖的全细胞催化甜菊苷转化。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YPH499 | 甜菊糖苷生物合成（异源表达） | UGT76G1 | UDP-糖基转移酶UGT76G1 | 催化 | 催化甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，使用密码子优化基因LC037193，由PGK1启动子组成型表达。 |
| Saccharomyces cerevisiae YPH499 | UDP-葡萄糖合成途径 | PGM2, UGP1等 | 磷酸葡萄糖变位酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶等 | 能量供给 | 内源酶系，用于体内生成糖供体UDP-葡萄糖；柠檬酸通过抑制磷酸果糖激酶调节碳流，增强UDP-葡萄糖供应。 |
关键发现
- 在含2 g/L甜菊苷的反应体系中，经1%甲苯渗透处理、30°C（或25°C）和pH
- 0等优化条件下，48 h内莱鲍迪苷A产量达1160.5 mg/L，转化率48%；1%甲苯渗透使产量提高77.6倍；pH
- 0时产量1000.7 mg/L（转化率42%）；添加20 g/L柠檬酸时产量441.6 mg/L；不添加Mg2+时产量974.7 mg/L；补料20或40 g/L葡萄糖使产量分别提高1.8和2.7倍；粗酶液最高比活力为2.737±0.206 mU/mg（培养16 h）。
研究结论
通过组成型表达UGT76G1并结合柠檬酸代谢调控，酿酒酵母全细胞催化可将甜菊苷高效转化为莱鲍迪苷A，且无需外源UDP-葡萄糖，为莱鲍迪苷A的经济生产提供了可行策略。