Cloning and Characterization of the Gene Encoding Alpha-Pinene Oxide Lyase Enzyme (Prα-POL) from Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 and Production of the Recombinant Protein in Escherichia coli
- 作者
- Pascal Dubessay, Christian Larroche, Pierre Fontanille
- DOI
- 10.1007/s12010-017-2685-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
鉴定α-蒎烯氧化物裂解酶（Prα-POL）的编码基因，并在大肠杆菌中实现重组表达，以提高异诺瓦醛（isonovalal）的生物转化生产效率。
研究策略
基于蛋白N端及内部肽段序列设计简并引物，通过PCR扩增部分基因片段；结合反向PCR（iPCR）和限制性酶切作图定位并克隆完整基因；构建pET28a载体在大肠杆菌BL21(DE3)中表达天然及His标签融合蛋白，并进行生物转化和酶动力学分析。
核心内容
该研究从Pseudomonas rhodesiae CIP 107491中鉴定并克隆了编码α-蒎烯氧化物裂解酶（Prα-POL）的基因，并在大肠杆菌中实现了重组表达。利用基于蛋白N端及内部肽段序列设计的简并引物，通过PCR扩增部分基因片段，结合反向PCR和限制性酶切作图成功分离完整基因。该基因长度为609 bp，编码202个氨基酸，预测分子量23.7 kDa，属于NTF2蛋白超家族。将基因构建至pET28a载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达天然及His标签融合蛋白，重组菌在双相系统中比生产速率达260 g异诺瓦醛 h⁻¹ g生物量⁻¹，较原菌提高约40倍，最大产物浓度达540 g/L。纯化后的N端His标签重组酶比酶活为546.37 μmol min⁻¹ mg⁻¹，接近天然酶的600 μmol min⁻¹ mg⁻¹。该工作首次报道了α-蒎烯氧化物裂解酶基因，为异诺瓦醛的高效生物转化生产及后续酶工程改造奠定了基础。
创新点
首次报道了α-蒎烯氧化物裂解酶基因的鉴定与克隆；利用反向PCR策略从Pseudomonas rhodesiae中成功分离该基因；在大肠杆菌中实现高活性重组表达，比生产速率较原菌提高约40倍。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 | α-蒎烯降解途径 | prα-POL | Prα-POL | 催化 | 天然的α-蒎烯氧化物裂解酶，催化α-蒎烯氧化物开环生成异诺瓦醛 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | prα-POL | 重组Prα-POL | 催化 | 在E. coli中重组表达，用于生物转化生产异诺瓦醛；比生产速率较原菌提高约40倍 |
| Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 | α-蒎烯降解途径相关基因簇 | GST | 谷胱甘肽S-转移酶 | 催化 | 与Prα-POL位于同一基因簇，推测参与芳香族化合物降解，但具体功能未在本研究验证 |
| Pseudomonas rhodesiae CIP 107491 | α-蒎烯降解途径相关基因簇 | CALDH | 松柏醛脱氢酶 | 催化 | 与Prα-POL位于同一基因簇，可能参与其他代谢途径，如丁香酚降解 |
关键发现
- Prα-POL基因长度为609 bp，编码202个氨基酸，预测蛋白分子量23.7 kDa，理论等电点5.23
- 重组大肠杆菌在双相系统中比生产速率约为260 g异诺瓦醛 h⁻¹ g生物量⁻¹，是P. rhodesiae（6.4 g h⁻¹ g⁻¹）的40倍
- 最大异诺瓦醛浓度达540 g/L
- 可溶组分中天然Prα-POL比酶活为98.57 μmol min⁻¹ mg⁻¹，N端His标签为134.15 μmol min⁻¹ mg⁻¹，C端His标签为373.30 μmol min⁻¹ mg⁻¹
- 纯化后N端His标签比酶活为546.37 μmol min⁻¹ mg⁻¹，接近天然P. rhodesiae酶的600 μmol min⁻¹ mg⁻¹，C端His标签为482.06 μmol min⁻¹ mg⁻¹
- Prα-POL与Solimonas soli的推定蛋白具有64%的氨基酸序列一致性。
研究结论
成功克隆了α-蒎烯氧化物裂解酶基因，并在大肠杆菌中实现了高活性重组表达，显著提高了异诺瓦醛的生产效率。该酶属于NTF2蛋白超家族，为后续酶工程改造和α-蒎烯降解途径研究奠定了基础。