Expression of Two Old Yellow Enzyme Homologues from Gluconobacter oxydans and Identification of their Citral Hydrogenation Abilities
- 作者
- Bo Yin, Xuepeng Yang, Guodong Wei, Yushu Ma, Dongzhi Wei
- 单位
- State key Lab of Bioreactor Engineering, New World Institute of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; College of Food and Biological Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China
- 杂志
- Molecular Biotechnology（2007）
- DOI
- 10.1007/s12033-007-9022-7
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定氧化葡萄糖杆菌中的两个旧黄酶同源物（GYE1和GYE2），并研究其对柠檬醛的加氢还原能力，特别是立体选择性还原柠檬醛顺式异构体（neral）为香茅醛。
研究策略
基于基因组序列分析鉴定同源基因，克隆至pET-28a载体并在大肠杆菌中表达His标签融合蛋白；通过添加核黄素补充FMN辅因子获得有活性酶；在双相反应体系中测定纯化酶对柠檬醛的生物转化活性，并通过GC/MS分析产物。
研究路线图
核心内容
该研究从氧化葡萄糖杆菌基因组中鉴定出两个旧黄酶同源基因gye1和gye2，克隆至pET-28a载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达His标签融合蛋白，通过添加核黄素补充FMN辅因子获得有活性的纯化酶。序列分析显示GYE1与GYE2间共享73.3%的一致性，与酵母OYE1的一致性分别为30%和31%。纯化蛋白产量约45 mg/L，SDS-PAGE显示单体约43 kDa，凝胶过滤表明天然状态为约80 kDa的二聚体。在含0.15 mg/ml纯酶、100 mM NADH/NADPH和40 mM柠檬醛的双相反应体系中，3小时内香茅醛浓度线性增加，且仅顺式异构体neral被还原，反式异构体geranial不受影响，表明GYEs能立体选择性还原柠檬醛的α,β-双键。该工作首次从氧化葡萄糖杆菌中鉴定并表达旧黄酶同源物，证明其作为新型NADH依赖的FMN氧化还原酶可将neral还原为香茅醛，为利用生物催化制备手性醛类化合物提供了新的酶资源。
创新点
首次从Gluconobacter oxydans中鉴定并表达两个旧黄酶同源物；证明GYEs能立体选择性还原柠檬醛的α,β-双键，且仅作用于顺式异构体neral，反式异构体geranial不受影响。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | NADH:flavin oxidoreductase/NADH oxidase家族（旧黄酶家族） | gye1 | GYE1 | 催化 | 来自Gluconobacter oxydans M5染色体，异源表达并纯化，立体选择性还原neral生成citronellal |
| Escherichia coli BL21(DE3) | NADH:flavin oxidoreductase/NADH oxidase家族（旧黄酶家族） | gye2 | GYE2 | 催化 | 来自Gluconobacter oxydans M5质粒，异源表达并纯化，功能与GYE1类似 |
关键发现
- GYE1和GYE2与酵母OYE1的序列一致性分别为30%和31%，相似性分别为43.5%和44%
- GYE1与Pseudomonas syringae pv. glycinea的NAD(P)H依赖2-环己烯-1-酮还原酶有75.1%相似性和64.9%一致性
- GYE1和GYE2之间共享73.3%序列一致性
- 纯化蛋白产量约45 mg/L，SDS-PAGE显示单体约43 kDa，凝胶过滤显示天然状态为约80 kDa二聚体
- 在含0.15 mg/ml纯酶、100 mM NADH/NADPH、40 mM citral的双相反应中，3小时内香茅醛浓度线性增加，且仅柠檬醛顺式异构体neral减少，geranial不减少。
研究结论
Gluconobacter oxydans的旧黄酶同源物GYE1和GYE2是新型NADH依赖的FMN氧化还原酶，能够立体选择性地还原柠檬醛α,β-不饱和羰基的碳碳双键，将顺式异构体neral还原为香茅醛，具有生物催化制备手性醛的潜力。