The NADP-dependent Glutamate Dehydrogenase Gene from the Astaxanthin Producer Xanthophyllomyces dendrorhous: Use of Its Promoter for Controlled Gene Expression
- 作者
- Marta Rodríguez-Sáiz, Ramiro P. Godio, Vanessa Álvarez, Juan Luis de la Fuente, Juan F. Martín, José Luis Barredo
- 杂志
- Molecular Biotechnology（2008）
- DOI
- 10.1007/s12033-008-9123-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆虾青素产生菌Xanthophyllomyces dendrorhous的NADP依赖性谷氨酸脱氢酶基因gdhA，并验证其启动子用于可控基因表达的可行性。
研究策略
通过构建基因组文库并利用Penicillium chrysogenum的gdhA基因片段为探针筛选得到gdhA基因；测序分析基因结构和调控元件；将该基因启动子与潮霉素抗性基因融合，通过电转化导入X. dendrorhous，检测转化子在含不同氮源培养基中的潮霉素抗性，验证启动子的调控功能。
核心内容
研究从虾青素生产菌Xanthophyllomyces dendrorhous中克隆了编码NADP依赖性谷氨酸脱氢酶的gdhA基因。通过构建基因组文库并以产黄青霉gdhA片段为探针筛选，获得4701 bp的基因组DNA片段，其中开放阅读框1871 bp，含5个内含子，编码455个氨基酸、分子量约49 kDa的蛋白，与新型隐球菌GDH同源性最高（70%）。启动子区域包含TATA盒和两个嘧啶富集区。将该启动子与潮霉素抗性基因融合后电转化入宿主，验证了其受氮源调控的功能：在Czapek-谷氨酸培养基中转化子可在50 μg/ml潮霉素下生长（干重约5–6 g/l），而在含30 mM乙酸铵的培养基中受抑制（干重仅0.5–1.5 g/l）。野生型与转化子的虾青素产量相当，约150–200 μg/g干重。该工作首次在担子菌中克隆gdhA基因并证实其启动子可作为受氮源调控的可控表达工具，为X. dendrorhous的代谢工程改造提供了新的遗传操作元件。
创新点
首次从担子菌（X. dendrorhous）中克隆gdhA基因并利用其启动子实现受氮源调控的外源基因表达；开发了电转化方法；证明启动子在高氨条件下受抑制，为代谢工程提供了可控表达工具。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 氮代谢/谷氨酸合成 | gdhA | NADP依赖性谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 氨同化关键酶，催化2-酮戊二酸还原胺化生成谷氨酸 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 基因表达调控 | PgdhA | — | 调控 | gdhA基因启动子，受氮源调控，用于可控基因表达 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 抗性筛选 | hygR | 潮霉素B磷酸转移酶 | 催化 | 来自E. coli，作为报告基因验证启动子功能 |
关键发现
- 测定的基因组DNA片段4701 bp，ORF 1871 bp，含5个内含子（长度分别为166、78、76、89、97 bp），编码455个氨基酸的蛋白，分子量约49 kDa
- 与新型隐球菌GDH同源性最高（70%）
- 启动子区域含TATA盒和两个嘧啶富集区
- PgdhA驱动的hygR基因在Czapek-谷氨酸培养基中可使转化子在50 μg/ml潮霉素下生长（干重约5-6 g/l），而在含30 mM乙酸铵的Czapek培养基中受抑制（干重仅0.5-1.5 g/l）
- 虾青素产量野生型和转化子相当，约150-200 μg/g干重（约0.5 mg/l）。
研究结论
成功克隆了X. dendrorhous的gdhA基因，其启动子PgdhA受氮源调控，能驱动潮霉素抗性基因表达，是担子菌代谢工程中可控基因表达的有用工具。