Development of Genetically Stable Escherichia coli Strains for Poly(3-Hydroxypropionate) Production
- 作者
- Yongqiang Gao, Changshui Liu, Yamei Ding, Chao Sun, Rubing Zhang, Mo Xian, Guang Zhao
- 单位
- CAS Key Laboratory of Biobased Materials, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, China; University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, China; Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, China; Collaborative Innovation Center for Marine Biomass Fibers, Materials and Textiles of Shandong Province, Qingdao, China
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0097845
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
解决重组大肠杆菌中因质粒丢失导致的菌株不稳定问题，提高P3HP产量
研究策略
采用染色体基因整合（CGI）和基于氨基酸营养缺陷型的质粒添加系统（PAS）两种策略，并组合使用，构建遗传稳定菌株
核心内容
针对重组大肠杆菌依赖质粒表达外源基因时因质粒丢失导致的菌株不稳定问题，该研究分别采用染色体基因整合（CGI）和基于氨基酸营养缺陷型的质粒添加系统（PAS）两种策略，并进一步将二者组合，构建遗传稳定的聚3-羟基丙酸（P3HP）生产菌株。原始两质粒菌株在无抗生素时P3HP产量仅0.34 g/L（15.5% CDW），加抗生素后为0.52 g/L；PAS策略将质粒稳定性提升至42.9%和27.2%，产量达0.55 g/L（22.5% CDW）；CGI菌株产量为0.26 g/L，随目的基因拷贝数增加升至0.50 g/L。组合策略菌株Q1638在不加抗生素时产量达2.01 g/L（42.6% CDW），加抗生素后为2.34 g/L。最终结合PAS的Q1738在补料分批发酵中产量达25.7 g/L（67.9% CDW），较此前报道的10.1 g/L提高2.5倍，为迄今利用廉价碳源生产P3HP的最高产量，证明在不依赖抗生素条件下通过染色体整合与营养缺陷型质粒系统的协同可有效实现菌株稳定与产物高产。
创新点
首次将染色体基因整合与氨基酸营养缺陷型质粒添加系统相结合，在不使用抗生素的条件下实现质粒稳定，大幅提高P3HP产量
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | P3HP生物合成 | dhaB123 | 甘油脱水酶（Glycerol dehydratase） | 催化 | 来自Klebsiella pneumoniae，编码甘油脱水酶三个亚基，催化甘油脱水生成3-羟基丙醛 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | P3HP生物合成 | gdrAB | 甘油脱水酶再激活因子（GdrAB） | 催化 | 来自Klebsiella pneumoniae，编码甘油脱水酶的再激活因子 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | P3HP生物合成 | pduP | 丙醛脱氢酶（PduP） | 催化 | 来自Salmonella typhimurium，催化3-羟基丙醛氧化为3-羟基丙酰辅酶A |
| Escherichia coli BL21(DE3) | P3HP生物合成 | phaC1 | 聚羟基脂肪酸合酶（PhaC1） | 催化 | 来自Cupriavidus necator，催化3-羟基丙酰辅酶A聚合为P3HP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 氨基酸合成（PAS） | tyrA | 分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶（TyrA） | 催化 | 用于酪氨酸营养缺陷型质粒添加系统，敲除染色体tyrA并在质粒上表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 氨基酸合成（PAS） | pheA | 分支酸变位酶-预苯酸脱水酶（PheA） | 催化 | 用于苯丙氨酸营养缺陷型质粒添加系统，敲除染色体pheA并在质粒上表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 基因表达调控 | lacI | LacI抑制子 | 调控 | 用于控制整合基因的表达（P17启动子） |
关键发现
原始两质粒菌株Q1359在不加抗生素时P3HP产量仅0.34 g/L（15.5% CDW），加抗生素后0.52 g/L（17.3%）。PAS策略菌株Q1509质粒稳定性提高至42.9%和27.2%，P3HP产量0.55 g/L（22.5%）。CGI菌株Q1599产量0.26 g/L（6.4%），随phaC1/pduP拷贝数增加产量升至0.50 g/L。组合策略Q1638产量2.01 g/L（42.6%，不加抗生素）和2.34 g/L（52.4%，加抗生素）。最终组合PAS的Q1738在补料分批发酵中产量达25.7 g/L（67.9% CDW），较之前10.1 g/L提高2.5倍，为目前利用廉价碳源生产P3HP的最高产量。
研究结论
通过构建遗传稳定重组大肠杆菌菌株Q1738，P3HP产量大幅提高至25.7 g/L，是迄今报道的利用廉价碳源生产P3HP的最高产量。