Engineering an Isoprenoid Pathway in Escherichia coli for Production of 2-Methyl-3-buten-2-ol: A Potential Biofuel
- 作者
- Dinesh Gupta, Michael L. Summers, Chhandak Basu
- 单位
- Department of Biology, California State University, Northridge
- 杂志
- Molecular Biotechnology（2013）
- DOI
- 10.1007/s12033-013-9721-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在大肠杆菌中异源合成2-甲基-3-丁烯-2-醇（MBO）作为潜在生物燃料，以克服乙醇作为燃料时能量密度低、回收成本高的缺点。
研究策略
通过在大肠杆菌中同时表达来自酿酒酵母的甲羟戊酸（MVA）途径完整基因（pMevT和pMBI质粒）以及来自沙宾松（Pinus sabiniana）的密码子优化的MBO合酶基因（pMBO质粒），将乙酰CoA转化为DMAPP，进而催化生成MBO，并优化培养条件（培养基、供氧）提高产量。
核心内容
该研究通过代谢工程手段在大肠杆菌中异源构建了2-甲基-3-丁烯-2-醇（MBO）的生物合成途径，旨在开发一种能量密度更高、回收成本更低的潜在生物燃料。研究者采用三质粒系统，同时表达来自酿酒酵母的完整甲羟戊酸（MVA）途径基因以及来自沙宾松的密码子优化MBO合酶基因，将乙酰辅酶A转化为DMAPP并进一步催化生成MBO。通过系统优化培养基和供氧条件，MBO产量实现显著提升：在Terrific Broth加氧条件下最高产量达到103.3 μl/L（0.985 mM），较不加氧条件提高3倍，而LB加氧条件下产量为50.7 μl/L，较不加氧提高1.6倍。毒性试验表明，在3 ml培养物中添加10 μl（31.6 mM）MBO不抑制细胞生长，仅添加12 μl（38.3 mM）时出现细胞毒性，说明实际产量远低于抑制浓度。体外酶活测定显示MBO合酶具有双重活性，MBO与异戊二烯产物比例约为90:1，但体内未检测到异戊二烯生成。该研究首次在大肠杆菌中实现MBO的异源生物合成，证明了其作为乙醇替代生物燃料的可行性，未来可通过菌株改造和工艺优化进一步提升产量。
创新点
首次在大肠杆菌中通过三质粒异源表达MVA途径和MBO合酶实现MBO的生产；使用密码子优化的MBO合酶基因；系统优化了培养基和供氧条件，使MBO产量提升3倍以上；证实MBO对宿主细胞的抑制浓度远高于实际产量。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α 和 SoluBL21 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | atoB | 乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 来自大肠杆菌，催化乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA，位于pMevT质粒 |
| Escherichia coli DH5α 和 SoluBL21 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMGS | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化乙酰乙酰CoA与乙酰CoA缩合为HMG-CoA，位于pMevT质粒 |
| Escherichia coli DH5α 和 SoluBL21 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMGR | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸，位于pMevT质粒 |
| Escherichia coli DH5α 和 SoluBL21 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸磷酸化，位于pMBI质粒 |
| Escherichia coli DH5α 和 SoluBL21 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化磷酸甲羟戊酸磷酸化，位于pMBI质粒 |
| Escherichia coli DH5α 和 SoluBL21 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MVD1 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸焦磷酸脱羧形成IPP，位于pMBI质粒 |
| Escherichia coli DH5α 和 SoluBL21 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 来自大肠杆菌，催化IPP异构化为DMAPP，位于pMBI质粒 |
| Escherichia coli DH5α 和 SoluBL21 | 异戊二烯途径（MBO合成） | MBOS | MBO合酶（2-甲基-3-丁烯-2-醇合酶） | 催化 | 来自Pinus sabiniana，密码子优化，催化DMAPP生成MBO，位于pMBO质粒 |
关键发现
- MBO产量在大肠杆菌DH5α（BG102）中为20 μl/L，在SoluBL21（BG104）中为31.5 μl/L
- 在Terrific Broth加氧条件下最高产量为103.3 μl/L（0.985 mM），较不加氧条件提高3倍
- LB加氧条件产量为50.7 μl/L（较不加氧提高1.6倍）
- MBO毒性试验表明3 ml培养物中添加10 μl（31.6 mM）MBO不抑制细胞生长，添加12 μl（38.3 mM）时出现细胞毒性
- IPTG诱导MVA途径使细胞提前进入稳定期并降低最终细胞密度
- 体外MBO合酶的双重活性中MBO与异戊二烯比例约为90:1，但体内未检测到异戊二烯生成。
研究结论
通过代谢工程在大肠杆菌中成功实现MBO的异源生物合成，最高产量接近0.985 mM，且远低于对宿主细胞的抑制浓度，表明MBO是一种具有前景的乙醇替代生物燃料，未来可通过菌株和培养工艺优化进一步提高产量。