The Biogenetic Origin of the Biologically Active Naematolin of Hypoloma Species Involves an Unusual Sesquiterpene Synthase
- 作者
- Suhad A. A. Al-Salihi, Trong Tuan Dao, Katherine Williams, Andy M. Bailey, Gary D. Foster
- 单位
- University of Bristol, UK
- 杂志
- Molecular Biotechnology（2019）
- DOI
- 10.1007/s12033-019-00199-x
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
Naematolin是一种由Hypholoma属产生的具有抗肿瘤、抗病毒等生物活性的倍半萜化合物，但其天然产量低且结构复杂，限制了其开发应用。核心问题在于缺乏其生物合成基因簇的认知，导致无法通过异源生产和组合生物合成获取该化合物及其衍生物。
研究策略
对Hypholoma fasciculare进行全基因组测序，结合antiSMASH和同源搜索预测倍半萜合酶基因；利用构巢曲霉（Aspergillus oryzae）作为异源宿主，对候选倍半萜合酶进行功能表达，并与邻近的FAD氧化酶基因共表达，通过色谱和波谱技术鉴定产物结构。
研究路线图
核心内容
本研究通过对簇生垂幕菇（Hypholoma fasciculare）进行全基因组测序（基因组草图58.84 Mbp，contig N50为49,633），结合antiSMASH预测和同源搜索，鉴定了17个倍半萜合酶候选基因。利用构巢曲霉（Aspergillus oryzae）作为异源宿主进行功能表达，发现Hfas94a和Hfas94b主要产生α-蒎烯及微量β-石竹烯，而非典型倍半萜合酶Hfas344可催化独特的1,11和2,10双环化反应，生成石竹烯异构体。将Hfas344与邻近的FAD依赖氧化酶（FADox）共表达后，成功产生四个氧化石竹烯衍生物，其中两个为新化合物，HRMS分别给出m/z 275.1625 [M+Na]+和m/z 259.1675 [M+Na]+。抗菌活性测试显示naematolin对枯草芽孢杆菌（500 μg时抑菌圈14 mm）和金黄色葡萄球菌（500 μg时13 mm）有抑制作用，但对铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌无活性。该工作首次从担子菌中鉴定出石竹烯合酶，并证明其与FADox协同可生成多种氧化衍生物，为naematolin的异源生物合成及基于石竹烯骨架的新型抗菌药物开发提供了关键基因资源和策略。
创新点
首次从担子菌中鉴定出石竹烯合酶（caryophyllene synthase），发现一个非典型倍半萜合酶Hfas344可催化1,11和2,10两次环化反应；通过异源共表达Hfas344与FADox，成功产生四个氧化石竹烯衍生物，其中两个为新化合物，为naematolin类化合物的组合生物合成和新型抗菌药物开发奠定基础。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Hypholoma fasciculare | naematolin/倍半萜生物合成 | — | — | — | 天然生产菌株，用于基因组测序和基因簇挖掘 |
| Hypholoma sublateritium | naematolin/倍半萜生物合成 | — | — | — | 同样产生naematolin，用于比较基因组学分析 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 倍半萜异源表达 | — | — | — | 异源表达宿主，用于候选基因功能验证 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 倍半萜生物合成 | Hfas344 | 非典型倍半萜合酶 | 催化 | 催化1,11和2,10环化，生成石竹烯异构体；GenBank: MK287938 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 倍半萜生物合成 | Hfas94a | 倍半萜合酶 | 催化 | 主要产物为α-蒎烯，微量β-石竹烯；GenBank: MK287936 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 倍半萜生物合成 | Hfas94b | 倍半萜合酶 | 催化 | 主要产物为α-蒎烯，微量β-石竹烯；GenBank: MK287937 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 倍半萜生物合成 | Hfas255 | 倍半萜合酶 | 催化 | 异源表达未检测到新产物 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 倍半萜生物合成 | FADox | FAD依赖氧化还原酶 | 催化 | 与Hfas344共表达，催化多步氧化反应生成四羟基化等石竹烯衍生物 |
关键发现
- H. fasciculare基因组草图大小为58.84 Mbp，contig N50为49,633；预测到17个倍半萜合酶（SQS），其中Hfas94a和Hfas94b异源表达主要产生α-蒎烯（Rt
- 91 min）和微量β-石竹烯（Rt
- 41 min）；非典型SQS Hfas344在A. oryzae中表达产生四个新代谢峰（主要产物Rt
- 13 min，被鉴定为石竹烯异构体）；Hfas344与FADox共表达后，石竹烯异构体峰消失，出现六个新峰，其中四个被纯化鉴定：(5β,6α,8β)-trihydroxycariolan、5β,8β-dihydroxycariolan以及两个新化合物2和3，HRMS分别给出m/z
- 1625 [M+Na]+（计算值275.1623）和m/z
- 1675 [M+Na]+（计算值259.1674）；naematolin的HRMS为m/z
- 1522（对应C17H24NaO3），抗菌活性测试显示对Bacillus subtilis（500 μg时抑菌圈14 mm）和Staphylococcus aureus（500 μg时13 mm）有活性，但对Pseudomonas aeruginosa和Klebsiella pneumoniae无活性；新化合物1-4对B. subtilis有弱活性。
研究结论
本研究首次从担子菌中鉴定出石竹烯合酶基因（Hfas344），并证明其与FAD氧化酶（FADox）协同作用可生成多种氧化石竹烯衍生物，其中包括两个新化合物。该工作为naematolin的异源生物合成和基于石竹烯骨架的新型抗菌药物开发提供了重要的基因资源和策略。