Specific mutation of transglutaminase gene from Streptomyces hygroscopicus H197 and characterization of microbial transglutaminase
- 作者
- WENJIE WAN, DONGLAN HE, ZHIJUN XUE, ZEWEN ZHANG
- 单位
- South-Central University for Nationalities, Wuhan 430070, People's Republic of China
- 杂志
- Journal of Biosciences（2017）
- DOI
- 10.1007/s12038-017-9707-4
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高微生物转谷氨酰胺酶（MTG）的活性和稳定性，通过删除特定序列获得高稳定性突变体
研究策略
利用重叠延伸PCR删除mtg基因中一段84 bp片段，将突变基因克隆至pET32a+载体并在E. coli Rosetta中表达，纯化后比较突变体与野生型MTG的酶学性质及稳定性
核心内容
本研究针对吸水链霉菌H197来源的微生物转谷氨酰胺酶（MTG），通过PyMOL结构分析设计并利用重叠延伸PCR删除了mtg基因中一段84 bp片段（对应28个氨基酸残基），将突变基因克隆至pET32a+载体并在E. coli Rosetta中表达，纯化后系统比较了突变体与野生型MTG的酶学性质。结果显示，纯化的突变型与野生型MTG活性分别为0.22 U/mg和0.16 U/mg，经胰蛋白酶激活后升至0.69 U/mg和0.54 U/mg。两者最适pH均为6–8，40°C下稳定，但突变体在50°C和60°C、pH 4/5/9、7%–9%盐度、30%–35%乙醇及Li(I)和Ag(I)存在下均显著比野生型更稳定（P<0.05或P<0.01）；60°C孵育100 min后突变体仍保留9%活性，而野生型仅5%。交联活性方面，100 min时氨释放量最高达13.4 mg/L（无乙醇）和13.0 mg/L（20%乙醇），表明突变体在维持交联功能的同时，因空间构象更紧凑而大幅提升了多种逆境条件下的稳定性，展现出良好的工业应用潜力。
创新点
首次通过PyMOL分析设计特定序列缺失，利用重叠延伸PCR实现mtg基因84 bp片段敲除；获得在温度、pH、盐度、乙醇等条件下稳定性显著提高的突变型MTG
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta (DE3) | 重组蛋白表达 | mtg / mutant mtg | 微生物转谷氨酰胺酶（MTG） | 催化 | 重组表达宿主，pET32a+载体，Trx融合促进可溶表达 |
| Streptomyces hygroscopicus H197 | 转谷氨酰胺合成 | mtg (GenBank: KY111759) | 微生物转谷氨酰胺酶（MTG） | 催化 | 原始来源菌株，分泌型MTG |
| — | 蛋白质交联（转谷氨酰胺酶反应） | mutant mtg (Δ84 bp) | 突变型MTG（缺失28个氨基酸残基） | 催化 | 通过重叠延伸PCR删除84 bp片段，获得稳定性增强的突变体 |
关键发现
- 纯化的突变MTG和野生MTG活性分别为0.22 U/mg和0.16 U/mg
- 胰蛋白酶激活后分别为0.69 U/mg和0.54 U/mg。突变体分子量约67 kDa。最适pH 6-8，40°C稳定，1-3%盐度稳定。突变体在50°C和60°C、pH 4、5、9、7%和9%盐度、30%和35%乙醇、Li(I)和Ag(I)存在下显著比野生型稳定（P<0.05或P<0.01）。在60°C孵育100 min后突变体保留9%活性，野生型5%。交联反应中，100 min时氨释放量最高13.4 mg/L（无乙醇）和13.0 mg/L（20%乙醇）。
研究结论
删除28个氨基酸残基的疏水序列可使MTG空间构象更紧凑，从而显著提高其在多种逆境条件下的稳定性，且不影响其交联活性，突变型MTG具有工业应用潜力。