Cloning, Expression, and Characterization of Xylose Reductase with Higher Activity from Candida tropicalis
- 作者
- Feiwei Zhang, Dairong Qiao, Hui Xu, Chong Liao, Shilin Li, Yi Cao
- 单位
- College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, P. R. China; Sichuan Public Experimental Platform of Bioinformatics and Metabolic Engineering, Chengdu 610064, P. R. China
- 杂志
- The Journal of Microbiology（2009）
- DOI
- 10.1007/s12275-008-0225-9
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
已有的木糖还原酶（XR）催化效率普遍不高，且多数C. tropicalis来源的XR为NADPH依赖型，限制了以木糖为底物发酵生产木糖醇的效率；需要筛选并表征具有高催化效率和合适辅酶特异性的新型XR。
研究策略
从高产木糖醇的C. tropicalis SCTCC 300249中克隆xyl1基因，构建pET32aXR载体并在E. coli BL21(DE3)中异源表达，通过Ni²⁺螯合亲和层析纯化重组蛋白，系统表征其pH、温度稳定性及酶动力学参数；随后将xyl1亚克隆入pYES2载体转化S. cerevisiae W303-1A，进行分批发酵评价木糖醇生产能力。
核心内容
本研究从高产木糖醇的热带假丝酵母SCTCC 300249中克隆了975 bp的木糖还原酶基因xyl1（GenBank EU273285），并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了可溶异源表达，重组蛋白约占细胞总蛋白的50%。经Ni²⁺亲和层析纯化后比活力达251.5 U/mg。该酶区别于已报道同类酶的关键特征在于双辅酶特异性，可同时利用NADPH和NADH，其催化效率kcat/Km达457.1 min⁻¹·mM⁻¹，为迄今表征的醛糖还原酶中最高，约为粗糙脉孢菌XR的4倍。酶学性质表征显示最适pH 5.5、最适温度45°C，在pH 4.0至6.5区间保持60%以上活性，1 mM DTT可提升酶活27%。将xyl1转化至酿酒酵母W303-1A后进行5 L发酵罐分批发酵，初始木糖100 g/L条件下，40 h木糖醇产量达93.67 g/L，产率2.34 g/L·h，得率约0.94 g/g。上述结果证明该XR优异的高催化活性和辅酶适应性使其成为木糖醇工业化生产极具潜力的催化剂，也为木糖还原酶辅酶特异性机制研究提供了理想材料。
创新点
['首次克隆并表征了C. tropicalis SCTCC 300249的木糖还原酶Xyl1，该酶具有双辅酶特异性（同时利用NADPH和NADH），显著不同于已报道的C. tropicalis XR仅依赖NADPH的特性', '该XR对木糖的催化效率（kcat/Km=457.1 min⁻¹·mM⁻¹）为迄今已表征的醛糖还原酶（aldose reductase）中最高，是粗糙脉孢菌XR的4倍以上', '该酶具有较宽的pH耐受范围（pH 4.0～6.5保持60%以上活性）及良好的温度适应性，适合木糖醇发酵应用']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Candida tropicalis SCTCC 300249 | 木糖代谢 | xyl1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | xyl1基因来源菌株，该菌株具有较高的木糖醇生产能力 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 木糖代谢 | xyl1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 异源表达宿主，通过pET32aXR载体IPTG诱导表达重组XR，用于酶学性质与动力学表征 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | 木糖代谢 | xyl1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 携带pYES2XR质粒，用于分批发酵生产木糖醇 |
关键发现
- 自C. tropicalis SCTCC 300249克隆到975 bp的xyl1基因（GenBank登录号EU273285），在E. coli BL21(DE3)中可实现溶表达，约占细胞总蛋白的50%
- 重组XR经纯化后比活力达251.5 U/mg，纯化7.1倍，回收率64.5%。该酶具有双辅酶特异性：对NADPH的Km为45.5 μM，对NADH的Km为161.9 μM
- 对木糖的Km为31.5 mM，kcat为1.44×10⁴ min⁻¹，kcat/Km为457.1 min⁻¹·mM⁻¹，为已报道醛糖还原酶中最高。最适pH为5.5，最适温度为45°C
- 60°C保温1 h丧失80%活性，半衰期约15 min。1 mg/mL BSA使酶活提高约20%，1 mM DTT提高27%。在S. cerevisiae W303-1A:pYES2XR的分批发酵中（5 L发酵罐，3 L工作体积，初始木糖100 g/L），40 h时木糖醇产量达93.67 g/L，木糖醇产率2.34 g/L·h，木糖醇/木糖得率约0.94 g/g，细胞干重最高7.63 g/L。
研究结论
本研究获得的C. tropicalis SCTCC 300249木糖还原酶具有双辅酶特异性、宽的pH耐受范围和良好的热稳定性，尤其是其极高的催化效率（kcat/Km=457.1 min⁻¹·mM⁻¹）使其成为木糖醇生产中极具应用潜力的生物催化剂；该研究同时为木糖还原酶辅酶特异性机制的进一步研究奠定了基础。