Transcriptome analysis of Δmig1Δmig2 mutant reveals their roles in methanol catabolism, peroxisome biogenesis and autophagy in methylotrophic yeast Pichia pastoris

解决的核心问题

阐明 Mig1 和 Mig2 转录抑制因子在毕赤酵母中调节甲醇分解代谢、过氧化物酶体生物发生和自噬的分子机制，特别是它们如何控制 AOX1 启动子的去阻遏。

研究策略

构建 Δmig1Δmig2 双敲除突变株，以甘油为碳源培养，利用 RNA-seq 进行全基因组转录组分析，比较突变株与野生型的基因表达差异；结合 GO 和 KEGG 通路富集分析、转录因子表达分析、启动子结合位点预测以及 qPCR 验证，揭示 Mig 蛋白的调控网络。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究通过构建毕赤酵母Δmig1Δmig2双敲除突变株，并在甘油为碳源的培养条件下进行全基因组RNA-seq转录组分析，系统揭示了Mig1和Mig2转录抑制因子在甲醇代谢调控中的分子机制。研究发现突变株中共有1554个基因差异表达，其中甲醇代谢途径基因显著上调：AOX1/AOX2转录水平提升32.6倍，DHAS上调6.2倍，同时多个过氧化物酶体生物发生相关基因如PEX6、PEX5等也出现2.3至3.2倍的协同上调。关键发现是转录因子Mit1在突变株中上调2.38倍，且其启动子含有Mig1结合基序，而AOX1启动子并无直接结合位点，表明Mig蛋白通过抑制Mit1p表达间接调控AOX1启动子去阻遏。此外，多数自噬相关基因在突变株中下调超过2倍，提示Mig蛋白对该过程具有广泛但轻微的调节作用。实验证实双敲除在甘油中强力去阻遏AOX表达，但葡萄糖下仍受抑制。该研究阐明了Mig蛋白作为全局转录抑制因子通过调控正转录因子Mit1p间接控制甲醇代谢途径的机制，为理解碳分解代谢物阻遏和优化甲醇诱导表达系统提供了理论基础。

创新点

首次对 Δmig1Δmig2 双缺失突变株进行全基因组转录组分析，发现 Mig 蛋白可能通过负调控转录因子 Mit1p 的表达来间接抑制 AOX1 启动子，并系统性揭示了甲醇代谢和过氧化物酶体生物发生相关基因的协同上调。

研究对象（31）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Pichia pastoris	碳分解代谢物阻遏/甲醇代谢调控	MIG1 (PAS_chr4_0334)	Mig1p	调控	转录抑制因子，与 Mig2p 协同抑制 AOX 表达，双敲除导致甘油中 AOX 去阻遏。
Pichia pastoris	碳分解代谢物阻遏/甲醇代谢调控	MIG2 (PAS_chr1-4_0526)	Mig2p	调控	Mig1p 同源物，部分参与分解代谢物阻遏，双敲除增强去阻遏效应。
Pichia pastoris	甲醇代谢	AOX1 (PAS_chr4_0821)	醇氧化酶 AOX	催化	催化甲醇氧化为甲醛和H2O2，转录水平上调32.6倍。
Pichia pastoris	甲醇代谢	AOX2 (PAS_chr4_0152)	醇氧化酶 AOX2	催化	醇氧化酶同工酶，上调超过30倍（与AOX1合计）。
Pichia pastoris	甲醇代谢（过氧化物酶体）	CAT	过氧化氢酶	催化	分解H2O2为水和氧气，上调1.5倍。
Pichia pastoris	甲醇代谢（解离途径）	FLD1	甲醛脱氢酶	催化	氧化甲醛，上调1.2倍。
Pichia pastoris	甲醇代谢（解离途径）	FGH	S-甲酰谷胱甘肽水解酶	催化	参与甲醛解离，变化不显著（0.9倍）。
Pichia pastoris	甲醇代谢（解离途径）	FMD	甲酸脱氢酶	催化	氧化甲酸生成CO2，上调2.4倍。
Pichia pastoris	甲醇代谢（同化途径）	DAS1 (PAS_chr3_0832)	二羟丙酮合酶	催化	催化甲醛与木酮糖-5-磷酸缩合，上调6.2倍。
Pichia pastoris	甲醇代谢（同化途径）	DAS2 (PAS_chr3_0834)	二羟丙酮合酶同工酶	催化	与DAS1同工，参与同化途径，表达上调。
Pichia pastoris	甲醇代谢（同化途径）	DAK	二羟丙酮激酶	催化	磷酸化二羟丙酮，参与甲醛同化。
Pichia pastoris	甲醇代谢（同化途径）	TPI	磷酸丙糖异构酶	催化	催化甘油醛-3-磷酸与磷酸二羟丙酮互变。
Pichia pastoris	甲醇代谢（同化途径）	FBA	果糖-1,6-二磷酸醛缩酶	催化	催化果糖-1,6-二磷酸裂解为三碳糖。
Pichia pastoris	甲醇代谢（同化途径）	FBP	果糖-1,6-二磷酸酶	催化	催化果糖-1,6-二磷酸水解为果糖-6-磷酸。
Pichia pastoris	过氧化物酶体生物发生	PEX1	Pex1p	区室化	参与过氧化物酶体基质蛋白导入，上调2.6倍。
Pichia pastoris	过氧化物酶体生物发生	PEX5	Pex5p	区室化	过氧化物酶体靶向信号受体，上调2.6倍。
Pichia pastoris	过氧化物酶体生物发生	PEX6	Pex6p	区室化	AAA ATPase，参与受体循环，上调3.2倍。
Pichia pastoris	过氧化物酶体生物发生	PEX14	Pex14p	区室化	过氧化物酶体膜对接因子，上调2.3倍。
Pichia pastoris	过氧化物酶体生物发生	PMP47B	Pmp47B	区室化	过氧化物酶体膜蛋白，上调2.75倍。
Pichia pastoris	甲醇代谢调控	MIT1 (PAS_chr3_0836)	Mit1p	调控	AOX1启动子的正转录因子，上调2.38倍；P_MIT1含Mig1结合位点。
Pichia pastoris	甲醇代谢调控	MXR1 (PAS_chr4_0487)	Mxr1p	调控	AOX1启动子的正转录因子，表达下调（log2 -1.21）。
Pichia pastoris	甲醇代谢调控	PRM1 (PAS_chr4_0203)	Prm1p	调控	AOX1启动子的正转录因子，上调1.27倍（log2）。
Pichia pastoris	甲醇代谢调控	NRG1 (PAS_chr3_1242)	Nrg1p	调控	AOX1启动子的负转录因子，变化不显著（log2 -1.09）。
Pichia pastoris	碳代谢调控	PAS_chr2-1_0757	Cat8p同源物	调控	转录激活因子，上调2.17倍，但敲除不影响AOX表达。
Pichia pastoris	自噬	ATG1	Atg1p	调控	自噬相关激酶，双敲除株中下调超过2倍。
Pichia pastoris	自噬	ATG5	Atg5p	调控	自噬体形成相关，下调超过2倍。
Pichia pastoris	自噬	ATG12	Atg12p	调控	参与Atg12-Atg5-Atg16复合物，下调超过2倍。
Pichia pastoris	自噬	ATG16	Atg16p	调控	自噬体形成相关，下调超过2倍。
Pichia pastoris	自噬	ATG26	Atg26p	调控	参与过氧化物酶体自噬，上调超过2倍。
Pichia pastoris	自噬	ATG27	Atg27p	调控	自噬相关蛋白，下调超过2倍。
Pichia pastoris	自噬	ATG28	Atg28p	调控	自噬相关蛋白，下调超过2倍。

关键发现

在 Δmig1Δmig2 突变株（甘油培养）中，共1554个基因差异表达，其中357个（约7%）显著上调，1197个（约23%）显著下调。甲醇代谢途径显著增强：AOX1/AOX2 转录上调超过30倍（具体为32.6倍），CAT 上调1.5倍，FLD1 上调1.2倍，FMD 上调2.4倍，DHAS 上调6.2倍。过氧化物酶体生物发生基因上调：PEX1
6倍、PEX5
6倍、PEX6
2倍、PEX14
3倍、PMP47B
75倍。转录因子 Mit1 上调2.38倍，且 P_MIT1 启动子含有 Mig1 结合基序，而 P_AOX1 无直接结合位点，提示 Mig 蛋白通过抑制 Mit1p 表达调控 AOX1。自噬相关基因多数下调（ATG1、ATG5、ATG12、ATG16、ATG27、ATG28 下调超过2倍，ATG26 上调超过2倍），表明 Mig 蛋白对自噬有轻微但广泛的调节作用。实验显示双敲除在甘油中强力去阻遏 AOX 表达，但在葡萄糖中仍受抑制。

研究结论

Mig1 和 Mig2 是毕赤酵母中重要的全局转录抑制因子，通过抑制 Mit1p 等正转录因子的表达，间接调控 AOX1 启动子及甲醇代谢途径，同时影响过氧化物酶体生物发生和自噬。该研究为深入理解甲醇诱导和碳分解代谢物阻遏机制提供了基础。