Molecular cloning, prokaryotic expression and induction characteristics of the sesquiterpene synthase gene (AsSS15) from the Chi-Nan germplasm (Aquilaria sinensis)
- 作者
- Zhenghan Bao, Peiwen Sun, Jianhe Wei, Xiaohong Fao, Feifei Lv, Yun Yang
- 杂志
- Physiology and Molecular Biology of Plants（2025）
- DOI
- 10.1007/s12298-025-01640-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析奇楠种质（Aquilaria sinensis）中倍半萜合酶基因AsSS15的分子特征与创伤诱导表达特性，阐明其在沉香倍半萜生物合成中的作用。
研究策略
采用PCR克隆获取AsSS15全长CDS，结合生物信息学分析蛋白结构；利用qRT-PCR分析组织表达与创伤诱导表达；通过原核表达与纯化获得重组蛋白，以FPP为底物进行体外酶活测定并通过GC-MS检测产物。
研究路线图
核心内容
本研究从奇楠种质沉香树中克隆得到倍半萜合酶基因AsSS15，其开放阅读框全长1812 bp，编码603个氨基酸，预测蛋白分子量为69.16 kDa，等电点5.92。生物信息学分析显示该蛋白含有RRX8W和DDxxD两个保守基序，与多种植物倍半萜合酶同源性超过62.66%，二级结构以α-螺旋为主。通过qRT-PCR分析发现，AsSS15在茎中表达量最高，且创伤诱导后表达水平上调近100倍，在奇楠种质中的基础表达量显著高于普通种质。将AsSS15构建至原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，获得大小约66.2 kDa的重组蛋白。体外酶活测定以法尼基焦磷酸为底物，经GC-MS检测确认重组AsSS15能够催化生成nerolidol，产量为14.36 μM，比活力达3.989 U/mg。上述结果表明AsSS15是一个功能性倍半萜合酶，参与奇楠种质沉香形成过程中倍半萜类化合物的生物合成，其创伤诱导表达特性与沉香形成机制密切相关，为解析奇楠种质高品质沉香的分子基础提供了重要线索。
创新点
首次从奇楠种质中克隆并功能鉴定倍半萜合酶基因AsSS15；证实其催化FPP生成nerolidol；发现创伤诱导可使其表达上调近100倍，且奇楠种质中表达水平显著高于普通种质，为奇楠种质沉香形成机制提供新见解。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成途径 | AsSS15 | AsSS15蛋白 | 催化 | 以FPP为底物催化生成nerolidol |
关键发现
- AsSS15基因全长1812 bp，编码603个氨基酸，蛋白分子量69.16 kDa，等电点5.92
- 保守基序RRX8W（59-69）和DDxxD（352-356）
- 与多种植物倍半萜合酶同源性>62.66%
- 二级结构中α-螺旋占58.0%，β-折叠占3.7%
- 亚细胞定位预测为叶绿体。qRT-PCR显示AsSS15在茎中表达最高，根和果实次之
- 创伤诱导后表达上调近100倍，且奇楠种质中表达显著高于普通种质。原核表达重组蛋白亚基约66.2 kDa
- 体外酶活测定显示重组AsSS15催化FPP生成nerolidol，产量为14.36 μM，总活性0.1596 U/mL，比活力3.989 U/mg
- 标准曲线y=2.19x-11.05，R²=0.8867。
研究结论
AsSS15是一个功能性倍半萜合酶，催化FPP生成nerolidol，在奇楠种质茎中高表达并受创伤诱导上调，参与沉香形成过程中倍半萜的生物合成，为理解奇楠种质沉香形成的分子机制提供了基础。