The acyl-CoA binding protein affects Monascus pigment production in Monascus ruber CICC41233
- 作者
- Chuannan Long, Mengmeng Liu, Xia Chen, Xiaofang Wang, Mingqiang Ai, Jingjing Cui, Bin Zeng
- 单位
- Jiangxi Key Laboratory of Bioprocess Engineering, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, People's Republic of China; School of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, People's Republic of China
- 杂志
- 3 Biotech（2018）
- DOI
- 10.1007/s13205-018-1147-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）是否影响Monascus ruber CICC41233中红曲色素（MPs）的生产及其机制，并确定MrACBP对脂酰辅酶A的结合偏好。
研究策略
从M. ruber CICC41233中克隆Mracbp基因，在E. coli Rosetta DE3中异源表达MBP-MrACBP融合蛋白，利用微尺度热泳（MST）测定对不同脂酰辅酶A的亲和力；通过农杆菌介导转化（ATMT）同源过表达Mracbp，分析过表达菌株的色素产量、脂肪酸组成及关键基因表达水平。
研究路线图
核心内容
研究从红曲霉Monascus ruber CICC41233中克隆了酰基辅酶A结合蛋白基因Mracbp，并在大肠杆菌中异源表达MBP-MrACBP融合蛋白。利用微尺度热泳测定其对不同脂酰辅酶A的亲和力，结果显示该蛋白对肉豆蔻酰辅酶A的Kd值为88.16 nM，显著低于棕榈酰辅酶A的136.07 nM和辛酰辅酶A的270.9 nM，说明MrACBP优先结合C14:0-CoA。通过农杆菌介导转化实现Mracbp同源过表达，6天后过表达菌株总红曲色素、水溶性色素和醇溶性色素产量分别比亲本提高11.67%、9.80%和12.70%，同时肉豆蔻酸含量从12.06%降至1.63%。关键基因acbp、pks、mppr1、fasA、fasB在2天时分别上调77.39倍、6.41倍、3.21倍、3.42倍和4.41倍。研究表明MrACBP通过扩大胞内脂酰辅酶A库并上调聚酮合酶、脂肪酸合酶及正调控因子的表达，降低了肉豆蔻酸含量并最终促进红曲色素积累，为红曲霉色素产量提升提供了新的代谢工程靶点。
创新点
首次在Monascus属中研究ACBP的功能；通过MST证实MrACBP对肉豆蔻酰辅酶A（C14:0-CoA）具有结合偏好；证明过表达Mracbp可提高红曲色素产量，并影响脂肪酸组成。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Monascus ruber CICC41233 | 红曲色素生物合成（聚酮和脂肪酸途径） | Mracbp | MrACBP（酰基辅酶A结合蛋白） | 转运 | 结合并转运脂酰辅酶A，过表达可提高色素产量并降低肉豆蔻酸含量 |
| Escherichia coli Rosetta DE3 | 异源表达 | Mracbp | MBP-MrACBP融合蛋白 | 转运 | 用于MST亲和力测定，证实对肉豆蔻酰辅酶A的偏好 |
| Monascus ruber CICC41233 | 红曲色素生物合成 | pks | 聚酮合酶（PKS） | 催化 | 催化聚酮链合成，是红曲色素生物合成的关键酶 |
| Monascus ruber CICC41233 | 红曲色素生物合成 | mppr1 | MppR1（正调控因子） | 调控 | 红曲色素基因簇中的正向转录调节因子 |
| Monascus ruber CICC41233 | 红曲色素生物合成（脂肪酸途径） | fasA | 脂肪酸合酶α亚基（FASα） | 催化 | 参与长链脂肪酸合成，为红曲色素提供脂酰辅酶A前体 |
| Monascus ruber CICC41233 | 红曲色素生物合成（脂肪酸途径） | fasB | 脂肪酸合酶β亚基（FASβ） | 催化 | 编码短链脂肪酸合酶，为色素合成提供C8/C10短链脂酰基 |
关键发现
- MST结合实验显示，MBP-MrACBP对myristoyl-CoA的Kd值为88.16 nM，对palmitoyl-CoA为136.07 nM，对octanoyl-CoA为270.9 nM，表明MrACBP对肉豆蔻酰辅酶A具有最高亲和力。在M. ruber ACBP5中，6天后总红曲色素、水溶性色素和醇溶性色素产量分别比亲本提高11.67%、9.80%和12.70%
- 肉豆蔻酸（C14:0）含量低于亲本（48 h时从12.06%降至1.63%）。关键基因acbp、pks、mppr1、fasA、fasB在2天时分别上调77.39倍、6.41倍、3.21倍、3.42倍、4.41倍，6天时分别上调4.03倍、3.58倍、1.67倍、2.11倍、2.62倍。
研究结论
MrACBP是一种长链脂酰辅酶A结合蛋白，尤其偏好结合肉豆蔻酰辅酶A。过表达Mracbp可降低红曲霉中肉豆蔻酸含量，通过扩大胞内脂酰辅酶A库并上调聚酮合酶、脂肪酸合酶及正调控因子的表达，最终提高红曲色素产量。