Genome mining and functional characterization of four type I sesquiterpene synthases from the Tiger Milk Mushroom Lignosus rhinocerus
- 作者
- Ming-Xuan Gao, Li-Li Guo, Meng-Ting Wang, Xin-Yi Zhang, Xinyang Li, Shin-Yee Fung, He-Ping Chen, Ji-Kai Liu
- 单位
- International Cooperation Base for Active Substances in Traditional Chinese Medicine in Hubei Province, School of Pharmaceutical Sciences, South-Central Minzu University, Wuhan, China; Medical Mushroom Research Group (MMRG), Mycological Sciences Laboratory, Department of Molecular Medicine, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 50603 Kuala Lumpur, Malaysia
- 杂志
- Natural Products and Bioprospecting（2026）
- DOI
- 10.1007/s13659-025-00578-9
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
虎奶菇（Lignosus rhinocerus）作为传统药用真菌，其次生代谢产物研究不足，且野生资源稀缺。需要从基因组中挖掘未表征的倍半萜合酶基因，通过功能表征揭示其产物结构，以理解其生物活性的化学基础。
研究策略
结合基因组挖掘、生物信息学分析、体外酶学测定和在大肠杆菌中异源表达（工程化外源甲羟戊酸途径），利用GC-MS和NMR对酶产物进行分离和结构鉴定。
研究路线图
核心内容
该研究通过基因组挖掘与功能表征策略，系统解析了药用真菌虎奶菇（Lignosus rhinocerus）中四个I型倍半萜合酶（LrhTS1–LrhTS4）的催化功能。研究团队首先对虎奶菇TM02菌株进行基因组测序，获得大小为34.3 Mb、编码10,742个推定基因的基因组序列，并通过BLAST分析鉴定出13个推定倍半萜合酶基因，其中4个被选为研究对象。随后，将这四个基因分别克隆至携带工程化外源甲羟戊酸途径的大肠杆菌BL21(DE3)衍生菌株中进行异源表达，结合体外酶学测定，利用GC-MS和NMR对酶促产物进行分离与结构鉴定。结果表明，LrhTS1和LrhTS3具有高催化特异性，各自仅产生一个主要产物，而LrhTS2和LrhTS4则表现出产物混杂性，生成多种倍半萜。共鉴定出11种倍半萜化合物，其中10种为Lignosus属首次报道。值得注意的是，部分化合物（如1、5、7）无法通过NIST数据库有效预测，必须依赖NMR确证结构。其中LrhTS3与已知合酶ILIS的序列一致性仅为27.22%，却产生相同产物iltremulanol A（化合物5）；化合物11鉴定为(+)-torreyol，比旋光度[α]+50.8。该研究首次完成了虎奶菇中四个I型倍半萜合酶的功能表征，极大扩展了对蘑菇萜类合酶催化多样性的认识，并揭示了虎奶菇活性化合物的化学基础，为后续该菌次生代谢产物的生物合成途径解析及药物开发奠定了基础。
创新点
首次对虎奶菇中四个I型倍半萜合酶（LrhTS1-LrhTS4）进行功能表征；共鉴定11种倍半萜，其中化合物1-10为该属首次报道；揭示LrhTS1和LrhTS3具有高催化特异性，LrhTS2和LrhTS4具有产物混杂性；发现部分化合物（1、5、7）无法通过NIST数据库有效预测，需结合NMR确证结构。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 甲羟戊酸途径 | atoB | 乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 来自E. coli ATCC25922，构建pMU02，用于提高IPP/DMAPP前体供给 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 甲羟戊酸途径 | erg13 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | 来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1，构建pMU02 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 甲羟戊酸途径 | thmg1 | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，可溶表达，构建pMU02 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 甲羟戊酸途径 | erg12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，构建pMU01 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 甲羟戊酸途径 | mvd1 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，构建pMU01 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 甲羟戊酸途径 | erg8 | 磷酸甲羟戊酸激酶（密码子优化） | 催化 | 来自酿酒酵母，构建pMU01 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 萜类前体生物合成 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 来自E. coli，同时存在于pMU01和pMX1-4质粒中 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 萜类前体生物合成 | ispA | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 来自E. coli BL21(DE3)，构建pMX1-4，提供FPP底物 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 倍半萜生物合成 | LrhTS1 | I型倍半萜合酶LrhTS1 | 催化 | 来自Lignosus rhinocerus TM02，产物为Δ6-protoilludene（化合物1），高特异性 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 倍半萜生物合成 | LrhTS2 | I型倍半萜合酶LrhTS2 | 催化 | 来自Lignosus rhinocerus TM02，产物包括化合物2-4（naphthene, δ-cadinene, cubenene），低选择性 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 倍半萜生物合成 | LrhTS3 | I型倍半萜合酶LrhTS3 | 催化 | 来自Lignosus rhinocerus TM02，产物为iltremulanol A（化合物5），高特异性，与ILIS序列一致性仅27.22% |
| Escherichia coli BL21(DE3)（衍生工程菌E. coli AH/FM） | 倍半萜生物合成 | LrhTS4 | I型倍半萜合酶LrhTS4 | 催化 | 来自Lignosus rhinocerus TM02，产物包括化合物5-11如(E)-β-farnesene, germacrene A, germacrene D等，低选择性 |
关键发现
- 虎奶菇TM02基因组大小为34.3 Mb，编码10,742个推定基因
- 通过BLAST分析发现13个推定倍半萜合酶基因，其中4个（LrhTS1-4）被功能表征。LrhTS1和LrhTS3分别仅产生一个主要产物（分子离子峰m/z 204和222），而LrhTS2和LrhTS4产生多个产物。共鉴定11个倍半萜（1-11），其中化合物1-10为Lignosus属首次报道。化合物2不稳定，可转化为2a
- 化合物7转化为7a。LrhTS3与已知合酶ILIS的序列一致性仅27.22%，但产生相同产物iltremulanol A（化合物5）。化合物11鉴定为(+)-torreyol，比旋光度[α]+50.8。化合物8确定为(7R)-germacrene D。
研究结论
通过基因组挖掘、体外酶活和异源表达，成功表征了虎奶菇中四个I型倍半萜合酶的功能，鉴定出11种倍半萜，扩展了对蘑菇萜类合酶及虎奶菇活性化合物多样性的认识，为后续生物合成和药物应用研究奠定了基础。