THE PATH OF CAROTENOID SYNTHESIS IN A PHOTOSYNTHETIC BACTERIUM
- 作者
- SYNNOVE LIAAEN JENSEN, GERMAINE COHEN-BAZIRE, T. O. M. NAKAYAMA, R. Y. STANIER
- 单位
- Departments of Bacteriology and Food Technology, University of California, Berkeley, Calif. (U.S.A.)
- 杂志
- Biochimica et Biophysica Acta（1958）
- DOI
- 10.1016/0006-3002(58)90003-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明光合细菌Rhodospirillum rubrum中脂肪族类胡萝卜素（尤其spirilloxanthin）合成路径的末端反应步骤，以及二苯胺（DPA）抑制正常类胡萝卜素合成时累积的饱和类胡萝卜素前体及其转化关系。
研究策略
以Rhodospirillum rubrum为材料，将指数生长期细胞重悬于无碳源的Hutner磷酸盐缓冲液中，在厌氧光照条件下追踪类胡萝卜素的相互转化；利用DPA（6×10⁻⁵~7×10⁻⁵ M）可逆抑制正常类胡萝卜素合成，使饱和前体累积；洗去抑制剂后进行内源性合成动力学分析；采用氧化铝柱层析分离并定量各种类胡萝卜素；通过差速离心确定色素在细胞内的亚细胞定位。
核心内容
该研究以光合细菌Rhodospirillum rubrum为材料，通过内源性合成动力学分析和二苯胺可逆抑制实验，阐明了类胡萝卜素生物合成的末端反应步骤及前体转化关系。研究者将指数期细胞重悬于无碳源缓冲液中厌氧光照培养，结合氧化铝柱层析分离定量各类胡萝卜素，并利用DPA阻断正常合成使饱和前体累积，洗脱抑制剂后追踪色素间的动态转化。实验证明spirilloxanthin的合成顺序为phytoene→phytofluene→ζ-carotene→neurosporene→lycopene→P481→spirilloxanthin，其中正常细胞中P481占总类胡萝卜素的68.5%，而在无碳源培养24小时后spirilloxanthin占比升至73%，P481减少113 μg而spirilloxanthin相应增加109.5 μg，直接证实了末端转化顺序。DPA处理使正常类胡萝卜素合成完全停止，但仅部分抑制生长和叶绿素合成，且累积的phytoene、phytofluene等前体均定位于色谱团中，表明DPA阻断的是neurosporene→lycopene等脱氢步骤而非末端反应。该研究首次建立了类胡萝卜素从无环前体到末端产物的完整合成链条，为紫色细菌中多条类胡萝卜素途径共享共同前体提供了证据，奠定了光合细菌类胡萝卜素生物合成研究的基础。
创新点
首次通过内源性合成动力学证明lycopene→P481→spirilloxanthin的末端转化顺序，并建立phytoene→phytofluene→ζ-carotene→neurosporene→lycopene的前体关系；证明DPA并非抑制末端反应，而是阻断neurosporene→lycopene等脱氢步骤；发现累积的类胡萝卜素前体均定位在色谱团（chromatophores）中。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodospirillum rubrum strain 1.1.1 | 类胡萝卜素生物合成途径（lycopene→P481→spirilloxanthin） | — | — | 催化 | 正常细胞中spirilloxanthin的末端合成转化步骤，由内源性合成动力学证实 |
| Rhodospirillum rubrum strain 1.1.1 | 类胡萝卜素生物合成途径（phytoene→phytofluene→ζ-carotene→neurosporene→lycopene） | — | — | 催化 | DPA抑制时累积的C40多烯前体系列，去除DPA后依次转化为正常类胡萝卜素 |
| Rhodospirillum rubrum strain 1.1.1 | 类胡萝卜素生物合成 | — | — | 区室化 | 类胡萝卜素及其前体（包括phytoene）均位于色谱团（chromatophores）中，差速离心显示phytoene在色谱团中8.9 μg/mg蛋白，可溶性部分仅0.225 μg/mg蛋白 |
| Rhodospirillum rubrum strain 1.1.1 | 类胡萝卜素合成调控 | — | — | 调控 | DPA（二苯胺）为化学抑制剂，7×10⁻⁵ M时完全阻遏正常类胡萝卜素合成，主要作用于neurosporene→lycopene及ζ-carotene→neurosporene等脱氢步骤 |
| Rhodopseudomonas spheroides | 类胡萝卜素生物合成途径（phytoene→phytofluene→ζ-carotene→neurosporene→Y→R） | — | — | 催化 | 基于褐、绿、蓝绿突变体表型推断的Y和R色素合成途径 |
| Rhodospirillum photometricum | 类胡萝卜素生物合成 | — | — | 催化 | 仅含lycopene和P481组，推断缺乏P481→spirilloxanthin转化能力 |
| Rhodospirillum molischianum | 类胡萝卜素生物合成 | — | — | 催化 | 仅含lycopene组，推断缺乏lycopene→P481转化能力 |
关键发现
- 指数期正常细胞中P481组占总类胡萝卜素的68.5%
- 在无碳源缓冲液中厌氧光照24 h，总类胡萝卜素量不变（244.0→244.6 μg/100 mg蛋白），但每100 mg蛋白中P481减少113 μg、spirilloxanthin增加109.5 μg，最终spirilloxanthin占总类胡萝卜素的73%
- 指数期细胞中可检测到phytofluene、ζ-carotene和neurosporene，分别占总类胡萝卜素的0.03%、0.2%和0.4%
- 7×10⁻⁵ M DPA使正常类胡萝卜素合成完全停止，而生长和叶绿素合成速率仅同程度下降
- DPA处理后3 h和9.25 h，300 ml样品中phytoene分别达38.5 μg和134.5 μg（校正后27.0和94.0 μg），phytofluene为4.8 μg和21.0 μg，ζ-carotene为5.1 μg和24.1 μg，neurosporene为1.8 μg和9.8 μg
- DPA生长细胞中正常类胡萝卜素约占总量的4%，lycopene完全缺失
- 去除DPA后，lycopene组在2–4 h内达最大后下降，P481组上升，spirilloxanthin最后出现
- phytoene在色谱团中含量为8.9 μg/mg蛋白，可溶性部分仅0.225 μg/mg蛋白。
研究结论
确立了R. rubrum中spirilloxanthin合成途径为phytoene→phytofluene→ζ-carotene→neurosporene→lycopene→P481→spirilloxanthin；单羟基衍生物参与并伴随主要类胡萝卜素的转化；DPA的作用是部分阻断脱氢步骤而非末端反应；该途径与紫色细菌中其他类胡萝卜素（Y、R等）合成途径共享共同前体步骤，可能代表一条通用的类胡萝卜素生物合成途径。