Molecular cloning and expression in Escherichia coli of a cyanobacterial gene coding for phytoene synthase, a carotenoid biosynthesis enzyme
- 作者
- Daniel Chamovitz, Norihiko Misawa, Gerhard Sandmann, Joseph Hirschberg
- 单位
- Department of Genetics, The Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem 91904, Israel; Lehrstuhl für Physiologie und Biochemie der Pflanzen, Universität Konstanz, Postfach 5560, D-7750 Konstanz, Germany
- 杂志
- FEBS Letters（1992）
- DOI
- 10.1016/0014-5793(92)80310-d
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
克隆蓝藻 Synechococcus PCC7942 中编码八氢番茄红素合成酶的基因 pys，并在大肠杆菌中异源表达验证其功能，以阐明类胡萝卜素生物合成途径的关键酶。
研究策略
从已克隆的 pds 基因下游基因组区域鉴定开放阅读框 pys；构建含 pys 与 crtE（GGPP 合酶）共表达的大肠杆菌系统，通过 HPLC 检测类胡萝卜素产物验证酶活性；对 PYS 氨基酸序列进行多序列比对并分析保守区域。
核心内容
该研究从蓝藻聚球藻PCC7942中克隆了编码八氢番茄红素合成酶的pys基因，并在大肠杆菌JM101中异源表达以验证其功能。研究者从已克隆的pds基因下游基因组区域鉴定出pys开放阅读框，其编码307个氨基酸的蛋白质，计算分子量约35.8 kDa。通过构建含pys与crtE共表达的大肠杆菌系统，利用HPLC检测类胡萝卜素产物，证明该酶为单一多肽酶，催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）经两步转化为八氢番茄红素。序列比对显示，PYS与番茄pTOM5的氨基酸序列具有59%的一致性和72%的相似性，与欧文氏菌CrtB的一致性和相似性分别为33%和50%。共表达crtE与pys的大肠杆菌积累八氢番茄红素，进一步共表达pds则积累顺式ζ-胡萝卜素，而共表达含crtE、crtI、crtY、crtZ、crtX但缺crtB的pACCAR25drtB质粒与pys时，细胞同时积累八氢番茄红素和玉米黄质，证实了pys在类胡萝卜素合成途径中的核心催化作用。该结果不仅首次阐明蓝藻八氢番茄红素合成酶的功能，还提示番茄pTOM5很可能编码同源酶，为后续植物类胡萝卜素代谢工程奠定了基础。
创新点
首次从蓝藻中克隆并表达 pys 基因；证明八氢番茄红素合成酶是单一多肽酶，催化 GGPP 经 PPPP 两步转化为 phytoene；揭示 pys 与番茄 pTOM5 的高度同源性，推测 pTOM5 编码番茄八氢番茄红素合成酶。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (strain JM101) | 类胡萝卜素生物合成途径 | pys | 八氢番茄红素合成酶（PYS） | 催化 | 来自 Synechococcus PCC7942，催化 GGPP 经 PPPP 两步生成 phytoene |
| Escherichia coli (strain JM101) | 类异戊二烯生物合成途径 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶（GGPP 合成酶） | 催化 | 来自 Erwinia uredovora，在 E. coli 中催化 GGPP 合成，为 phytoene 合成提供底物 |
| Escherichia coli (strain JM101) | 类胡萝卜素生物合成途径 | pds | 八氢番茄红素脱氢酶（PDS） | 催化 | 来自 Synechococcus PCC7942，催化 phytoene 脱氢生成 cis ζ-carotene |
| Escherichia coli (strain JM101) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶（CrtI） | 催化 | 来自 Erwinia uredovora，位于 pACCAR25drtB 质粒，参与 phytoene 到 lycopene 的脱氢反应 |
| Escherichia coli (strain JM101) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 来自 Erwinia uredovora，位于 pACCAR25drtB 质粒，催化 lycopene 环化生成 β-carotene |
| Escherichia coli (strain JM101) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自 Erwinia uredovora，位于 pACCAR25drtB 质粒，催化 β-carotene 羟基化生成 zeaxanthin |
| Escherichia coli (strain JM101) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtX | 玉米黄质葡萄糖苷酶 | 催化 | 来自 Erwinia uredovora，位于 pACCAR25drtB 质粒，催化 zeaxanthin 糖基化 |
| — | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合成酶（CrtB） | 催化 | 来自 Erwinia uredovora 和 Rhodobacter capsulatus，作为序列比对参考，与 PYS 具有同源性 |
| 番茄（Solanum lycopersicum） | 类胡萝卜素生物合成途径 | pTOM5 | 八氢番茄红素合成酶（推定） | 催化 | 番茄果实成熟差异表达 cDNA，与 PYS 有 59% 一致性和 72% 相似性，推测编码番茄八氢番茄红素合成酶 |
关键发现
- pys 基因编码 307 个氨基酸的蛋白，计算分子量约 35.8 kDa，疏水指数为 -0.4
- PYS 与番茄 pTOM5 氨基酸序列有 59% 一致性和 72% 相似性，与 E. uredovora CrtB 有 33% 一致性和 50% 相似性，与 Rb. capsulatus CrtB 有 30% 一致性和 44% 相似性
- 共表达 crtE 和 pys 的 E. coli 细胞积累 phytoene
- 共表达 crtE、pys、pds 积累 cis ζ-carotene
- 共表达 pACCAR25drtB（含 crtE、crtI、crtY、crtZ、crtX，缺 crtB）和 pys 积累 phytoene 与 zeaxanthin。
研究结论
pys 编码八氢番茄红素合成酶，为单一多肽酶，催化 GGPP 向 phytoene 的转化；番茄 pTOM5 很可能编码同源的八氢番茄红素合成酶。