Molecular cloning and functional expression in E. coli of a novel plant enzyme mediating \(\zeta\) -carotene desaturation
- 作者
- Manuela Albrecht, Annelyse Klein, Philippe Hugueney, Gerhard Sandmann, Marcel Kuntz
- 单位
- Biosynthesis Group, Fachbereich Biologie, J.W. Goethe Universität, Frankfurt; Institut de Biologie Moléculaire des Plantes du CNRS, Strasbourg
- 杂志
- FEBS Letters（1995）
- DOI
- 10.1016/0014-5793(95)00978-i
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物中催化ζ-胡萝卜素脱氢生成番茄红素的酶（ζ-胡萝卜素脱氢酶，ZDS）尚未被克隆和功能鉴定，其与已知蓝藻Anabaena ZDS的关系不明。
研究策略
基于与已知八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的序列相似性，搜索EST数据库获得候选克隆；利用RT-PCR从拟南芥获得部分cDNA片段作为探针，筛选辣椒果实cDNA文库，获得全长cDNA；将cDNA导入可积累不同类胡萝卜素底物的大肠杆菌菌株中共表达，通过HPLC分析验证其催化功能。
核心内容
本研究首次从辣椒果实中克隆了编码ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）的全长cDNA，并对其进行了功能鉴定。研究者基于与八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的序列相似性搜索EST数据库，利用RT-PCR获得探针筛选cDNA文库，将候选基因转入可积累不同类胡萝卜素底物的大肠杆菌中共表达，并通过HPLC分析验证催化功能。结果表明，CapZDS编码588个氨基酸的前体蛋白，成熟蛋白约59.4 kDa；在积累ζ-胡萝卜素的菌株中，全长酶可将底物转化为链孢红素和番茄红素，而截短形式（删除前54个密码子）的转化效率更高，使ζ-胡萝卜素更有效转化为链孢红素（28.2 fg/g）和番茄红素（19.8 fg/g），总转化率约18%。该酶不能脱氢八氢番茄红素或番茄红素。序列比较显示，植物ZDS与辣椒PDS的一致性为35.5%，与蓝藻PDS更为相似，而与蓝藻Anabaena ZDS仅有少量短区域相似，提示植物ZDS与PDS可能由编码四步脱氢反应的祖先酶基因复制分化而来，该进化事件发生较早。
创新点
首次从植物（辣椒）中克隆了编码ζ-胡萝卜素脱氢酶的cDNA；该酶与植物和蓝藻的PDS序列相似性显著高于与蓝藻Anabaena ZDS的相似性，提示植物ZDS与PDS可能由共同祖先基因复制分化而来。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE, crtB | GGPP合酶、八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，用于在大肠杆菌中合成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素生物合成 | pds | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Synechococcus，催化八氢番茄红素脱氢生成ζ-胡萝卜素 |
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Rhodobacter capsulatus，用于合成链孢红素 |
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素生物合成 | CapZDS | ζ-胡萝卜素脱氢酶 | 催化 | 来自辣椒Capsicum annuum，全长cDNA，催化ζ-胡萝卜素和链孢红素转化为番茄红素；截短形式pCapZDS/TP缺失前54个密码子，活性更高 |
| — | — | — | CapZDS前体蛋白的质体转运肽 | 区室化 | NH2-末端延伸，预测靶向质体；缺失该转运肽的截短形式在E. coli中具有更高催化效率 |
关键发现
- 辣椒CapZDS cDNA编码588个氨基酸的前体蛋白（MW 64.7 kDa），成熟蛋白约59.4 kDa。功能表达显示：在积累ζ-胡萝卜素的大肠杆菌中，全长pCapZDS将252.0 fg/g的ζ-胡萝卜素生成3.8 fg/g链孢红素和1.0 fg/g番茄红素
- 在积累链孢红素的细胞中，将105.8 fg/g链孢红素生成26.1 fg/g番茄红素。截短形式pCapZDS/TP（删除前54个密码子）使ζ-胡萝卜素更有效转化为链孢红素（28.2 fg/g）和番茄红素（19.8 fg/g），总转化率约18%。该酶不能脱氢八氢番茄红素或番茄红素。序列比较显示与辣椒PDS的一致性为35.5%（相似性59%），与Synechococcus PDS的一致性为33.5%（相似性58%），与Anabaena ZDS仅存在少量短区域相似。
研究结论
成功克隆并功能鉴定了植物来源的ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS），该酶催化ζ-胡萝卜素经链孢红素转化为番茄红素，属于PDS型脱氢酶家族。植物ZDS与PDS可能来自一个编码四步脱氢反应的祖先酶基因复制与分化，该事件在进化中发生较早。