Identification of Target Genes of the bZIP Transcription Factor OsTGAP1, Whose Overexpression Causes Elicitor-Induced Hyperaccumulation of Diterpenoid Phytocalexins in Rice Cells
- 作者
- Koji Miyamoto, Takashi Matsumoto, Atsushi Okada, Kohei Komiyama, Tetsuya Chujo, Hirofumi Yoshikawa, Hideaki Nojiri, Hisakazu Yamane, Kazunori Okada
- 单位
- Department of Biosciences, Teikyo University, Utsunomiya, Tochigi, Japan; Biotechnology Research Center, The University of Tokyo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan; Genome Research Center, NODAI Research Institute, Tokyo University of Agriculture, Setagaya-ku, Tokyo, Japan; Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture, Setagaya-ku, Tokyo, Japan
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0105823
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
OsTGAP1是调控水稻二萜类植保素（momilactones和phytocassanes）生物合成的bZIP转录因子，但缺乏对其直接靶基因和调控机制的了解。本研究旨在通过全基因组鉴定OsTGAP1靶基因，阐明其促进激发子诱导植保素超量积累的分子机制。
研究策略
结合ChIP-seq与DNA微阵列转录组分析，在OsTGAP1过表达水稻细胞中鉴定全基因组In vivo结合区域和差异表达基因，交集得到潜在靶基因；并通过ChIP-PCR、凝胶迁移实验（GMSA）和瞬时反式激活实验验证OsDXS3的直接调控。
核心内容
该研究通过整合ChIP-seq与DNA微阵列转录组分析，在水稻悬浮细胞中全基因组鉴定了bZIP转录因子OsTGAP1的靶基因。ChIP-seq在未处理和激发子处理条件下分别鉴定出2763和2777个结合区域，其中约70%为两种条件共有，约41%位于基因间区，结合区域内TGACGT序列富集约8倍。转录组分析显示OsTGAP1过表达导致2268个基因上调和2276个基因下调，与ChIP-seq取交集后共获得122个直接靶基因。值得注意的是，植保素生物合成基因簇成员均非OsTGAP1直接靶标，但多个结合位点分布于簇内及邻近基因间区，提示间接调控机制。在MEP途径中仅OsDXS3启动子被OsTGAP1直接结合，凝胶迁移实验证实其通过两个TGACGT序列结合，双突变可消除结合；反式激活实验显示250 bp启动子报告基因在OsTGAP1共表达下LUC活性提高7倍。这些结果表明OsTGAP1通过直接激活OsDXS3增强MEP途径碳通量，同时通过基因间区结合及下调OsWRKY76等负调控因子间接激活植保素基因簇，从而促进激发子诱导的二萜植保素超量积累。
创新点
首次对水稻bZIP转录因子OsTGAP1进行全基因组ChIP-seq分析，发现其结合位点大量分布于基因间区；揭示植保素生物合成基因簇并非OsTGAP1的直接靶基因，而是可能通过基因间区结合间接调控；证明OsTGAP1直接结合OsDXS3启动子上两个TGACGT序列激活其表达。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 水稻悬浮培养细胞 (Oryza sativa cv. Nipponbare) | 二萜植保素生物合成调控 | OsTGAP1 | OsTGAP1 (bZIP转录因子) | 调控 | 转录因子；过表达增强激发子诱导的植保素超积累 |
| 水稻悬浮培养细胞 | MEP途径 | OsDXS3 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS) | 催化 | OsTGAP1直接靶基因；启动子含两个TGACGT序列 |
| 水稻悬浮培养细胞 | MEP途径 | OsDXR, OsCMS, OsCMK, OsMCS, OsHDS, OsHDR | MEP途径酶 | 催化 | 多个基因在OsTGAP1ox细胞中表达上调，但非直接靶基因 |
| 水稻悬浮培养细胞 | momilactone生物合成 | OsCPS4, OsKSL7, CYP99A2, CYP99A3, OsMAS | 二萜环化酶/P450/脱氢酶 | 催化 | 基因簇位于4号染色体；非直接靶基因，但表达在OsTGAP1ox中增强 |
| 水稻悬浮培养细胞 | phytocassane生物合成 | OsCPS2, OsKSL4, CYP71Z7, CYP76M7, CYP76M8, CYP701A8 | 二萜环化酶/P450 | 催化 | 基因簇位于2号染色体；非直接靶基因 |
| 水稻悬浮培养细胞 | 防御反应 | OsWRKY76 | OsWRKY76 (WRKY转录因子) | 调控 | OsTGAP1靶基因，在OsTGAP1ox细胞中下调，负调控植保素生物合成基因 |
关键发现
- ChIP-seq在未处理和激发子处理条件下分别鉴定出2763和2777个OsTGAP1结合区域，其中2003个（约70%）为共有
- 约41%位于基因间区。结合区域中TGACGT序列富集约8倍。转录组分析表明，OsTGAP1过表达细胞在0、6、24 h分别有1352、1539、1267个基因上调和1278、1387、1624个基因下调，合并后上调2268、下调2276。结合ChIP-seq和转录组，共鉴定122个OsTGAP1靶基因（86个上调、36个下调）。植保素基因簇中任何一个生物合成基因都不是直接靶基因，但多个结合位点位于簇内及邻近基因间区。MEP通路中仅OsDXS3在启动子区有OsTGAP1结合位点
- GMSA证实OsTGAP1通过两个TGACGT序列结合，任一突变减弱结合，双突变消除结合。反式激活实验中，250 bp OsDXS3启动子报告基因在OsTGAP1共表达下LUC活性提高7倍
- 两个TGACGT均突变或缺失TGACGT的240 bp片段显著降低LUC活性。OsTGAP1ox细胞中所有momilactone生物合成基因和phytocassane基因簇内多个基因（如OsCPS2、CYP76M5-8、CYP71Z6）出现超诱导表达。
研究结论
OsTGAP1主要通过间接机制调控二萜植保素生物合成基因簇的表达，但直接结合OsDXS3启动子并通过两个TGACGT序列激活其转录，从而增强MEP途径的碳通量，促进激发子诱导的植保素超量积累。此外，OsTGAP1还可能通过下调OsWRKY76等负调控因子间接激活植保素基因簇。