Cloning, sequencing and functional assignment of the chlorophyll biosynthesis gene, chlP, of Synechocystis sp. PCC 6803
- 作者
- Hugh A. Addlesee, Lucien C.D. Gibson, Poul E. Jensen, C. Neil Hunter
- 单位
- Robert Hill Institute for Photosynthesis and Krebs Institute for Biomolecular Research, Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Sheffield, Sheffield S10 2UH, UK
- 杂志
- FEBS Letters（1996）
- DOI
- 10.1016/0014-5793(96)00549-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定 Synechocystis sp. PCC 6803 中叶绿素生物合成基因 chlP 的功能，即编码催化 geranylgeraniol 逐步氢化为 phytol 的酶
研究策略
基于 R. capsulatus bchP 与 Arabidopsis EST 的保守区设计简并引物，PCR 扩增获得 Synechocystis 同源片段，筛选基因组文库克隆 chlP 基因；将该基因置于强启动子下异源表达于 R. sphaeroides bchP 突变体 T6G5 中，通过 HPLC 分析色素组成和全细胞吸收光谱验证功能
研究路线图
核心内容
本研究从蓝藻 Synechocystis sp. PCC 6803 中克隆并功能鉴定了叶绿素生物合成基因 chlP。作者基于 Rhodobacter capsulatus bchP 与拟南芥 EST 的保守区设计简并引物，通过 PCR 扩增同源片段并筛选基因组文库获得 chlP 全长基因。该基因开放阅读框长 1224 bp，预测蛋白分子量 44869 Da，与 R. capsulatus BchP 氨基酸序列同一性为 37%。将 chlP 置于强启动子下异源表达于 R. sphaeroides bchP 突变体 T6G5 中，HPLC 分析显示色素组成得到部分恢复，检测到 bchlaP 和 bchlaTHGG 各约 5.8%，另有大量 bchlaDHGG 及 bchlaGG；全细胞吸收光谱表明 LH2 复合物水平升高，B850 峰相对突变体的红移减小约 2 nm。结果表明 chlP 编码催化 geranylgeraniol 逐步氢化为 phytol 的氢化酶，该酶在叶绿素 a 生物合成末端氢化步骤中发挥作用，且这一功能在蓝藻与光合细菌间具有保守性，研究为理解光合色素合成途径的进化提供了依据。
创新点
首次克隆并功能鉴定了 Synechocystis 的 chlP 基因；利用异源互补策略证明了该基因编码催化叶绿素生物合成末端氢化步骤的氢化酶；发现该酶可部分恢复 bchP 突变体的色素组成和 LH2 复合物表型
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 叶绿素a生物合成 | chlP | ChlP | 催化 | ORF 1224 bp，预测分子量 44869 Da，与 R. capsulatus BchP 有 37% 氨基酸同一性 |
| Rhodobacter sphaeroides | 细菌叶绿素a生物合成 | bchP | BchP | 催化 | 突变体 T6G5 缺失该基因，仅积累 bchlaGG，异源表达 chlP 后部分恢复表型 |
| Rhodobacter capsulatus | 细菌叶绿素a生物合成 | bchP | BchP | 催化 | 用于设计简并引物的同源基因，其编码蛋白与 ChlP 同源 |
关键发现
- chlP 基因 ORF 长 1224 bp，预测蛋白分子量 44869 Da，与 R. capsulatus BchP 氨基酸序列同一性为 37%。在 R. sphaeroides bchP 突变体 T6G5 中异源表达 chlP 后，HPLC 检测到 bchlaP 约
- 8%，bchlaTHGG 约
- 8%，同时检测到大量 bchlaDHGG 及 bchlaGG。全细胞吸收光谱显示 LH2 水平提高，B850 红移较突变体减小约 2 nm（突变体相对野生型红移约 6 nm）。
研究结论
Synechocystis chlP 基因编码一种氢化酶，负责催化叶绿素 a 生物合成中 geranylgeraniol 逐步氢化为 phytol 的步骤，该过程可能发生在酯化前或酯化后，且与细菌叶绿素 a 生物合成的末端氢化步骤相似。