Photoregulated Carotenoid Biosynthetic Genes of Neurospora crassa
- 作者
- Giorgio Morelli, Mary Anne Nelson, Paola Ballario, Giuseppe Macino
- 杂志
- Methods in Enzymology（1993）
- DOI
- 10.1016/0076-6879(93)14085-w
- 所属领域
- 分子生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明粗糙脉孢菌中类胡萝卜素生物合成基因的光调控机制，特别是克隆GGPP合酶（al-3+）基因并研究其光诱导表达。
研究策略
通过构建al-3 qa-2 aro-9三重突变体，利用质粒库转化互补筛选al-3+转化子，再通过质粒拯救和亚克隆技术分离al-3+基因，并用RFLP作图验证基因位置，最后通过Northern杂交分析光诱导转录。
核心内容
本研究以粗糙脉孢菌为材料，旨在阐明类胡萝卜素生物合成基因的光调控机制。通过构建al-3 qa-2 aro-9三重突变体，利用质粒库转化互补筛选并借助质粒拯救与亚克隆技术，成功分离了al-3+基因，经RFLP作图将其定位于连锁群V的cyh-2和inl之间。序列与功能分析证实al-3+编码GGPP合酶，并鉴定出异戊烯基转移酶家族的三个保守结构域。Northern杂交表明，光诱导条件下al-3基因转录显著增加，且该诱导依赖wc-1和wc-2基因产物的功能。转化筛选显示，稳定al-3+转化子频率约为每5000至10000个qa-2+转化子中出现1个，约20%的初级转化子产生深橙色分生孢子。结果证实al-3+基因编码GGPP合酶且受蓝光及white collar基因调控，为理解真菌类胡萝卜素生物合成的光调控通路奠定了基础。
创新点
成功克隆了al-3+基因，证明其编码GGPP合酶；揭示光诱导转录需要white collar基因产物；鉴定出异戊烯基转移酶家族三个保守结构域。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成 | al-3+ | GGPP合酶 | 催化 | 催化香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的合成 |
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成 | al-1+ | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 催化八氢番茄红素脱氢反应 |
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成 | al-2+ | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 催化八氢番茄红素合成 |
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成光调控 | wc-1 | WC-1蛋白 | 调控 | 光调控因子，参与光诱导基因表达 |
| Neurospora crassa | 类胡萝卜素生物合成光调控 | wc-2 | WC-2蛋白 | 调控 | 光调控因子，与WC-1协同调控光诱导基因表达 |
关键发现
- pNC39质粒在池9中以10^-4频率存在
- 稳定al-3+转化子频率约为每5000-10000个qa-2+转化子中出现1个
- 约20%的初级转化子产生深橙色分生孢子，约80%的转化子含功能性al-3+基因
- 光诱导条件下al-3基因转录显著增加，且依赖wc-1和wc-2功能
- RFLP定位显示al-3位于连锁群V的cyh-2和inl之间。
研究结论
研究证实al-3+基因编码GGPP合酶，其表达受蓝光诱导且受white collar基因调控，为理解真菌类胡萝卜素光调控通路提供了基础。