Mutagenesis and Biochemical Analysis of Recombinant Yeast Prenyltransferases
- 作者
- Brian E. Caplin, Mark S. Marshall
- 杂志
- Methods in Enzymology（1995）
- DOI
- 10.1016/S0076-6879(95)50062-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
建立重组酵母蛋白异戊二烯转移酶的诱变和生化分析方法，以研究其结构、功能及底物特异性。
研究策略
利用酿酒酵母温度敏感突变株和E. coli重组共表达系统，通过定点突变、体外酶活测定、底物筛选及异戊二烯基团化学切割与HPLC鉴定，解析FTase和GGTase I的亚基功能。
核心内容
该研究建立了重组酵母蛋白异戊二烯转移酶的诱变与生化分析体系，以解析法尼基转移酶（FTase）和香叶基香叶基转移酶I（GGTase I）的结构-功能关系。利用酿酒酵母温度敏感突变株及大肠杆菌重组共表达系统，通过定点突变、体外酶活测定、CaaX底物变体筛选以及异戊二烯基团的化学切割与HPLC鉴定，实现了对亚基功能的快速检测。结果显示，野生型酵母提取物对Ras-CVLS的法尼基转移活性为25.0 pmol/mg，ram1突变体降至1.0 pmol/mg，而重组FTase对Ras-CVIM的活性达40,482 pmol/mg；RAM1的S309位点突变几乎完全丧失活性，F261N262和Y263突变影响较小。每升培养物可获得约28,000单位FTase和8,800单位GGTase I。该工作表明酵母与哺乳动物的异戊二烯转移酶在机制上高度保守，所建立的共表达与突变分析策略可高效鉴定基因功能，为针对该靶点的抗癌药物开发提供了可靠模型。
创新点
开发了在酵母粗提物和重组E. coli中快速检测蛋白异戊二烯转移酶活性的方法；通过共表达和定点突变实现了对亚基结构-功能的分析；利用CaaX底物变体和HPLC区分法尼基与香叶基香叶基修饰。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 蛋白质异戊二烯化修饰 | RAM1 | Ram1p (FTase β亚基) | 催化 | 法尼基转移酶β亚基，突变导致FTase活性降低 |
| Saccharomyces cerevisiae | 蛋白质异戊二烯化修饰 | RAM2 | Ram2p (FTase/GGTase I共同α亚基) | 催化 | 共同α亚基，为FTase和GGTase I所共有 |
| Saccharomyces cerevisiae | 蛋白质异戊二烯化修饰 | CDC43 | Cdc43p (GGTase I β亚基) | 催化 | GGTase I β亚基，突变影响香叶基香叶基转移活性 |
| Escherichia coli | 异源表达 | RAM1 + RAM2 | 重组FTase | 催化 | 共表达产生具有活性的重组FTase，用于突变分析 |
| Escherichia coli | 异源表达 | CDC43 + RAM2 | 重组GGTase I | 催化 | 共表达产生具有活性的重组GGTase I |
关键发现
- 野生型酵母提取物对Ras-CVLS的法尼基转移活性为25.0 pmol/mg，ram1突变体降至1.0 pmol/mg，cdc43突变体为35.0 pmol/mg
- 重组FTase对Ras-CVIM的FPP活性为40,482 pmol/mg，对CIIS为53,267 pmol/mg
- RAM1突变体S309几乎完全丧失FTase活性（cpm接近0），而F261N262和Y263突变对活性影响较小
- 每升培养物可获得约28,000单位FTase和8,800单位GGTase I。
研究结论
酵母蛋白异戊二烯转移酶与哺乳动物酶在机制和底物特异性上高度保守，重组表达和定点突变结合的方法可快速鉴定基因功能并用于结构-功能研究，为抗癌药物开发提供模型。