高级醇 · 代谢工程文献库

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Significant contribution of arginine-112 and its positive charge of Pseudomonas putida cytochrome P-450cam in the electron transport from putidaredoxin

作者
Kazuhide Nakamura, Tadao Horiuchi, Takanori Yasukochi, Kazuhisa Sekimizu, Takayuki Hara, Yasuhiro Sagara
单位
Department of Microbiology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University 62, Higashi-ku, Fukuoka 812, Japan; Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, Soka University, Hachioji, Tokyo 192, Japan; Department of Food and Nutrition, Nakamura Gakuen College, Jonan-ku, Fukuoka 814-01, Japan; Department of Medical Biology, Kochi Medical School, Nankoku, Kochi 783, Japan
杂志
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology（1994）
DOI
10.1016/0167-4838(94)90049-3
所属领域
酶工程
关键词
ArginineElectron transferP-450camP. putidaPutidaredoxin
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解决的核心问题

阐明 Pseudomonas putida 细胞色素 P-450cam 的 Arg-112 残基及其正电荷在与 putidaredoxin 的电子传递过程中的作用。

研究策略

通过定点突变将 P-450cam 的 Arg-112 分别替换为中性 Gln 和负电 Glu，在大肠杆菌中表达并纯化突变蛋白，利用重构系统比较其与底物 d-camphor 及氧化型 putidaredoxin 的结合亲和力、电子传递速率、光谱性质和稳定性。

研究路线图

100%
研究问题：Arg-112正电荷在P-450cam与Pd电子传递中的作用
策略：定点突变Arg112→Gln中性，→Glu负电
大肠杆菌表达并纯化野生型与突变蛋白
关键改造验证：底物d-camphor亲和力基本不变（Kd≈2μM）
Electron关键改造：Pd结合亲和力显著降低（28→240→530μM）
结果：电子传递速率kobs剧降（45.5 s⁻¹→9.0×10⁻³→9×10⁻⁴ s⁻¹）
结果：heme保留量下降（36%→11%）及热稳定性降低
结论：Arg-112正电荷对Pd结合与电子传递至关重要，并维持heme与稳定性
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核心内容

该研究通过定点突变系统解析了Pseudomonas putida细胞色素P-450cam中Arg-112残基及其正电荷在电子传递中的功能。研究者将Arg-112分别替换为中性的Gln和负电的Glu，在大肠杆菌中表达纯化突变蛋白，并比较了其与底物d-camphor、氧化型putidaredoxin的结合以及电子传递效率。结果显示，Arg-112的替换对底物亲和力几乎无影响（Kd介于1.8~2.4 μM），但导致与putidaredoxin的亲和力下降约8至19倍，电子传递速率分别降至野生型的约1/5000和1/50000。此外，突变蛋白的heme保留量大幅降低，纯化蛋白heme含量从野生型的20.6 nmol/mg降至6.0 nmol/mg，50°C处理120分钟后剩余活性也从70%降至13%。这些结果表明Arg-112的正电荷不仅是高效电子传递所必需的，还通过维持氢键网络稳定heme结合，影响酶的热稳定性和全酶形成，为理解P450电子传递机制提供了关键结构基础。

创新点

首次系统证明 Arg-112 的正电荷对 P-450cam 与 putidaredoxin 的相互作用及高效电子传递至关重要，并发现该残基还影响蛋白的 heme 保留和热稳定性。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli (菌株RRI) 樟脑降解途径 camC 细胞色素P-450cam 催化 野生型及Arg-112定点突变体（Arg112-Gln和Arg112-Glu）在大肠杆菌中表达并纯化，催化樟脑的立体选择性羟基化。
— 樟脑降解途径 camB putidaredoxin 能量供给 酸性铁硫蛋白，作为电子载体从 putidaredoxin reductase 接受电子并传递给 P-450cam；突变体对氧化型 putidaredoxin 的亲和力降低影响电子传递。
— 樟脑降解途径 camA putidaredoxin reductase 催化 黄素蛋白，催化 NADH 氧化并将电子传递给 putidaredoxin，构成重构系统中的还原力供给部分。

关键发现

  1. 野生型对 d-camphor 的 Kd 为
  2. 4 μM，Arg112-Gln 为
  3. 9 μM，Arg112-Glu 为
  4. 8 μM，底物亲和力基本不变；对氧化型 putidaredoxin 的 Kd：野生型 28 μM，Arg112-Gln 240 μM（约8倍），Arg112-Glu 530 μM（约19倍），亲和力显著降低；还原反应速率常数 kobs：野生型
  5. 5 s^-1，Arg112-Gln
  6. 0×10^-3 s^-1（约为野生型的1/5000），Arg112-Glu
  7. 0×10^-4 s^-1（约为野生型的1/50000）；大肠杆菌中 heme 含量分别为野生型的 36% 和 11%；纯化蛋白的 heme 含量：野生型
  8. 6 nmol/mg，Arg112-Gln
  9. 9 nmol/mg，Arg112-Glu
  10. 0 nmol/mg；50°C处理120 min后剩余活性：野生型70%，Arg112-Gln 40%，Arg112-Glu 13%。

研究结论

Arg-112 的正电荷是 P-450cam 与 putidaredoxin 高效结合和电子传递所必需的，该残基的氢键网络和电荷特性同时维持 heme 的稳定结合，影响酶的热稳定性和 holo-enzyme 的形成。