Kinetics of continuous GM-CSF production by recombinant Saccharomyces cerevisiae in an airlift bioreactor
- 作者
- Chin-Hang Shu, Shang-Tian Yang
- 单位
- Department of Chemical Engineering, The Ohio State University
- 杂志
- Journal of Biotechnology（1996）
- DOI
- 10.1016/0168-1656(96)01409-5
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组酿酒酵母在气升式生物反应器中连续生产GM-CSF时面临质粒不稳定导致产物产量下降的问题，需研究连续培养动力学及操作策略以改善质粒稳定性和产物合成。
研究策略
采用选择培养基进行反应器启动以积累细胞，随后切换至富含乙醇的非选择培养基进行GM-CSF生产；考察不同稀释率（0.05、0.08、0.11 h⁻¹）及稀释率振荡（0.05/0.11 h⁻¹）对质粒稳定性和产物合成的影响；应用双参数动力学模型拟合质粒丢失动力学并估算遗传参数。
研究路线图
核心内容
研究者以重组酿酒酵母XV2181在气升式生物反应器中连续生产粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），重点考察质粒不稳定对产物合成的影响。采用选择培养基启动反应器积累细胞，随后切换至富含乙醇的非选择培养基进行生产，并比较不同稀释率（0.05、0.08、0.11 h⁻¹）及稀释率振荡（0.05/0.11 h⁻¹每36 h切换）下的发酵表现。结果显示，连续培养可持续150 h以上，但质粒携带细胞比例降至约20%；稀释率从0.11 h⁻¹降至0.05 h⁻¹时，相对质粒丢失率从1.1%升至16.0%，表明高稀释率有利于质粒稳定。连续培养中平均GM-CSF浓度从42.5 mg/L降至24.1 mg/L，产物产率却从2.1 mg/L/h升至2.65 mg/L/h，而稀释率振荡的平均产率达2.52 mg/L/h，优于恒定0.08 h⁻¹的2.07 mg/L/h。双参数动力学模型揭示质粒不稳定性主要源于分离性丢失而非生长竞争劣势。该研究证明高稀释率及稀释率振荡能有效改善质粒稳定性和产物产率，为重组酵母连续发酵策略优化提供了动力学依据。
创新点
首次在气升式生物反应器中系统研究重组酵母连续生产GM-CSF的动力学；发现连续培养后期质粒携带细胞比例降至20%以下但产量降幅较缓，归因于高拷贝数细胞的自然选择导致特异性产率上升；证明稀释率振荡能有效提高质粒稳定性和产物产率。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae XV2181 | GM-CSF表达 | ADH2 | Adh2p | 调控 | 葡萄糖抑制型启动子，控制外源GM-CSF基因转录，乙醇为碳源时去抑制表达 |
| Saccharomyces cerevisiae XV2181 | GM-CSF表达 | TRP1 | 磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶 | 催化 | 编码色氨酸合成途径酶，作为质粒选择性标记（营养缺陷型筛选） |
| Saccharomyces cerevisiae XV2181 | GM-CSF表达 | GM-CSF cDNA | GM-CSF | 调控 | 目标产物，鼠源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，属于细胞因子，连续培养中分泌到胞外 |
关键发现
- 连续培养可持续150 h以上，质粒携带细胞比例降至约20%
- 稀释率从0.11 h⁻¹降至0.05 h⁻¹时，相对质粒丢失率θ从1.1%升至16.0%，生长速率比α从0.996升至0.998
- 批次培养中乙醇为碳源时最高GM-CSF浓度达70.8 mg/L，而葡萄糖培养基仅少量
- 连续培养中细胞密度随稀释率增加从11.5 g/L降至8.5 g/L，平均GM-CSF浓度从42.5 mg/L降至24.1 mg/L，产物产率从2.1 mg/L/h升至2.65 mg/L/h（0.05 vs 0.11 h⁻¹）
- 稀释率振荡（0.05/0.11 h⁻¹每36 h切换）平均产率为2.52 mg/L/h，优于恒定0.08 h⁻¹的2.07 mg/L/h。
研究结论
连续培养相比批次培养能提高GM-CSF产率；高稀释率有利于质粒稳定性和产物合成；稀释率振荡是改善质粒稳定性和产率的有效操作策略；动力学模型表明质粒不稳定性主要由分离性不稳定（θ）而非竞争性生长劣势（α）引起。